制動(dòng)對(duì)幼鼠骨維生素d受體表達(dá)的影響

制動(dòng)對(duì)幼鼠骨維生素d受體表達(dá)的影響

廢用性骨質(zhì)疏松癥（dop）常出現(xiàn)在臨床疾病和宇宙機(jī)場(chǎng)，并因各種疾病而引起的。而長期臥床、運(yùn)動(dòng)能力受限和外科制動(dòng)的患者以及宇航員都可發(fā)生DOP。它也已成為小兒骨關(guān)節(jié)疾病、外傷、骨關(guān)節(jié)手術(shù)后接受長期固定患兒術(shù)后康復(fù)的重要障礙,甚至發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松性骨折,影響原發(fā)疾病的治療和康復(fù),但其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。維生素D作為一種抗骨質(zhì)疏松的重要藥物,已經(jīng)廣泛地用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,乃至成年人DOP的防治中。但針對(duì)維生素D及其相應(yīng)的內(nèi)分泌系統(tǒng)在DOP發(fā)病機(jī)制中的作用鮮有研究,且制動(dòng)是否可通過影響全身和(或)局部的維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡,尤其是影響維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)的數(shù)目和功能而對(duì)DOP的發(fā)生發(fā)展起一定的作用,至今也未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過復(fù)制幼齡大鼠DOP動(dòng)物模型,觀察制動(dòng)對(duì)大鼠局部骨組織中VDR表達(dá)的影響,探討VDR表達(dá)變化與DOP發(fā)生的關(guān)系。1材料和方法1.1驅(qū)動(dòng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量(90±15)g,封閉群,二級(jí)動(dòng)物(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為4組,每組10只,其中第1、3組為實(shí)驗(yàn)組,分別制動(dòng)2周和4周,第2、4組分別為相應(yīng)同齡正常對(duì)照組。制動(dòng)組鼠術(shù)后和對(duì)照組鼠分組置于大鼠專用飼養(yǎng)籠,每籠5只在清潔級(jí)動(dòng)物房中同條件飼養(yǎng)。1.2sp-4試驗(yàn)劑兔抗鼠VDR抗體(c-20)(SANTACruz公司);兔SP-Kit試劑盒(北京中杉);DAB顯色劑(北京中杉);中性乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣液(自備)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1大鼠制動(dòng)試驗(yàn)采用腿-尾固定法制備幼鼠DOP模型(右后肢制動(dòng)),其中第1組大鼠制動(dòng)2周;第2組大鼠作為第1組的同齡對(duì)照進(jìn)行飼養(yǎng);第3組大鼠制動(dòng)4周;第4組大鼠作為第3組的同齡對(duì)照進(jìn)行飼養(yǎng)。1.3.2下一步實(shí)驗(yàn)方法分別在制動(dòng)2周和制動(dòng)4周后,在10%的水合氯醛(0.2mL/100g)麻醉下放頸動(dòng)脈血處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠,取對(duì)照組鼠的右后肢及實(shí)驗(yàn)組鼠的雙后肢,剔除軟組織,留取股骨和脛骨進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。1.3.3骨組織組織病理學(xué)檢測(cè)股骨濕重。取各組剔除干凈軟組織后的右股骨用電子分析天平(FA2004B型,上海精密儀器公司)稱取濕重(精確至0.1mg)。股骨和脛骨骨礦含量和骨密度測(cè)定。采用DPX雙能X線骨密度儀(美國Lunar公司)測(cè)量各組大鼠的右側(cè)股、脛骨(標(biāo)本置于水浴中,后前位擺放,水深2.3cm)的骨礦含量(bonemineralcontent,BMC)和骨密度(bonemineraldensity,BMD),分別精確至0.01g和0.01g/cm2。股骨灰重。收集完成骨密度測(cè)量后的各組右股骨置于烘箱中[(105±1)℃]烘干1h,轉(zhuǎn)入高溫爐內(nèi)800℃灰化1h,干燥器中冷卻至室溫,電子分析天平測(cè)量灰重,精確至0.1mg。脛骨近側(cè)干骺端組織學(xué)觀察及骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)定。取完成骨密度測(cè)量后的各組右脛骨近側(cè)干骺段,10%中性甲醛固定24～48h,流水沖洗,10%中性EDTA液4～8℃脫鈣3～4周,流水沖洗,冠狀對(duì)剖,80%、90%、95%酒精順濃度梯度脫水,每步2～4h,氯仿透明4h(兩次),組織浸蠟,石蠟包埋,5μm切片,HE染色,鏡下觀察脛骨近側(cè)干骺端骨組織形態(tài)改變。各組隨機(jī)選6張切片,在OLYMBAS顯微攝像鏡下(放大10×10),每張切片在干骺端生長板下區(qū)隨意選取3視野,將圖象捕獲入計(jì)算機(jī)。利用Mios-2000圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)檢測(cè):每視野中骨小梁面積(μm2)和每視野中骨小梁周長(μm),取3視野的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。脛骨近側(cè)干骺端骨組織VDR檢測(cè)。將實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)脛骨近側(cè)干骺端,按照上述方法制備石蠟包埋組織,連同已制得的各組右脛骨近側(cè)干骺端骨石蠟包埋組織,5μm切片,以SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)骨組織VDR表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行(一抗滴度1∶128,以生理鹽水代替一抗作為陰性對(duì)照)。光鏡下觀察染色情況,了解VDR表達(dá)的部位,每組隨機(jī)選6張切片,每張切片在干骺端生長板下區(qū)隨意選取3～6個(gè)視野,將圖象捕獲入計(jì)算機(jī)。并用Mias-2000圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)測(cè)定染色的深度(灰階分析法)和面積,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,半定量了解制動(dòng)對(duì)骨組織VDR表達(dá)的影響。1.4統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析,α=0.05。2結(jié)果2.1第3周意外卡入籠間隙死亡實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在制動(dòng)后均能以余下3腿進(jìn)行自由活動(dòng)和覓食,其中第3組有1只幼鼠在第3周意外卡入籠間隙死亡,給予淘汰。各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)2周和4周的制動(dòng)后,制動(dòng)右后肢與對(duì)側(cè)相比肌肉明顯萎縮,且股、脛骨均明顯比對(duì)側(cè)短小(圖1、圖2)。2.2右后后肢鎖的影響是大腿重量和灰色重量結(jié)果見表1。幼鼠在右后肢制動(dòng)2周和4周后均可導(dǎo)致右后肢股骨的濕重和灰重分別低于同齡對(duì)照組(P<0.05)。2.3小鼠骨髓bmd、md下降情況結(jié)果見表2。幼鼠在右后肢制動(dòng)2周后,與同齡對(duì)照組相比,右后肢股骨BMD下降31%,脛骨BMD下降約35%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在右后肢制動(dòng)達(dá)4周后,與同齡對(duì)照組相比,右后肢股骨BMD下降28%,脛骨BMD下降約25%,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.4骨小梁的排列和形態(tài)結(jié)果見表3、圖3～圖5。幼鼠制動(dòng)組在右后肢制動(dòng)2周時(shí)即出現(xiàn)右側(cè)脛骨骨小梁稀疏,骨小梁間吻合減少,制動(dòng)4周可見紐扣樣改變,并可見骺板下區(qū)空曠,骨小梁纖細(xì),髓腔擴(kuò)大。而對(duì)照組大鼠右側(cè)脛骨近端骨小梁排列緊密,結(jié)構(gòu)正常。幼鼠在右后肢制動(dòng)2周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積約為同齡對(duì)照組的68.2%,骨小梁周長約為同齡對(duì)照組的76.8%;在右后肢制動(dòng)達(dá)4周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積僅約為同齡對(duì)照組的28.8%,骨小梁周長則約為同齡對(duì)照組的39.4%,與制動(dòng)2周時(shí)相比,隨著制動(dòng)時(shí)間的延長,兩者均有明顯的下降。2.5骨生長板區(qū)和生長板下區(qū)的表達(dá)結(jié)果見表4、圖6～圖8。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的胞漿、核膜被染成棕黃色,表明這些部位有VDR表達(dá),尤其是在骨骺生長板區(qū)和生長板下區(qū)表達(dá)較強(qiáng)。在右后肢制動(dòng)后盡管脛骨近側(cè)干骺端骨組織VDR(2周)可能在早期出現(xiàn)表達(dá)面積的減少,但其在單個(gè)成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞中的表達(dá)量卻略顯增強(qiáng)(染色深度增加),在制動(dòng)4周后,制動(dòng)側(cè)脛骨近側(cè)干骺端骨組織的VDR表達(dá)高于同齡對(duì)照組和自身對(duì)照(左后肢)。3討論3.1小鼠制動(dòng)地變形結(jié)構(gòu)模型本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上采用腿-尾固定法成功建立了幼鼠DOP模型。實(shí)驗(yàn)中,通過對(duì)幼齡大鼠制動(dòng)肢(右后肢)骨濕重、灰重、骨密度等的觀測(cè),發(fā)現(xiàn)右后肢股骨和脛骨上述反映骨量的指標(biāo)均明顯降低,組織學(xué)的變化則直觀地反映出了制動(dòng)后骨結(jié)構(gòu)的細(xì)微改變,制動(dòng)側(cè)肢體的骨小梁出現(xiàn)明顯稀疏反映出制動(dòng)對(duì)骨結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的影響,這些都充分說明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出幼鼠DOP模型。3.2制動(dòng)影響骨組織中vdr表達(dá)的機(jī)制維生素D在骨生長和代謝、骨鈣平衡方面具有極其重要的作用,其生理功能均通過受體起作用。VDR廣泛分布于腸道上皮細(xì)胞、肝腎臟細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞乃至皮膚組織等50余種組織中。該受體基因被認(rèn)為定位在人類12號(hào)染色體q臂上。VDR基因本身的表達(dá)受到多種因子的調(diào)節(jié),包括IGF-1等,而活性維生素D則通過VDR對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)節(jié)而發(fā)揮維生素D激素的生理功能。迄今為止,人們對(duì)VDR與骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究主要集中在VDR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松易感性及其對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)生的預(yù)測(cè)上。有關(guān)VDR表達(dá)量的改變與骨質(zhì)疏松的關(guān)系研究很少,更未見到制動(dòng)對(duì)骨組織中VDR表達(dá)影響的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),在給予制動(dòng)4周后,幼鼠制動(dòng)側(cè)肢體脛骨近側(cè)干骺端骨組織中成骨細(xì)胞VDR表達(dá)升高,其原因可能與制動(dòng)后成骨細(xì)胞功能加強(qiáng)有關(guān)。有研究認(rèn)為,制動(dòng)后骨組織中的骨形成和骨吸收的過程均會(huì)加強(qiáng),但骨吸收大于骨形成而最終出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。在此過程中,成骨和破骨細(xì)胞的代謝活動(dòng)均會(huì)加強(qiáng)。一方面,成骨細(xì)胞活動(dòng)的加強(qiáng),可能直接促進(jìn)維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活,包括骨VDR表達(dá)的增加;另一方面,破骨細(xì)胞前體的成熟和破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能也需要成骨細(xì)胞的VDR數(shù)目增加和功能加強(qiáng),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞對(duì)PTH、維生素D的反應(yīng),釋放出包括PG、TGF-1及IL-1等細(xì)胞因子刺激破骨細(xì)胞成熟,增強(qiáng)其骨吸收功能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。而另有研究發(fā)現(xiàn),截癱和制動(dòng)均可導(dǎo)致體內(nèi)維生素D3水平下降,在低維生素D3水平下成骨細(xì)胞要完成上述制動(dòng)后所需要的一系列功能活動(dòng),可能只有通過反饋機(jī)制使得細(xì)胞自身中的VDR表達(dá)增加或受體功能增加來彌補(bǔ)維生素D激素的不足(低激素水平對(duì)受體的上調(diào)作用)。另外,制動(dòng)還可由于對(duì)其他內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響而最終影響VD