gf-對(duì)小鼠股骨骨折修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

gf-對(duì)小鼠股骨骨折修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

長(zhǎng)期以來(lái)，從骨折愈合過(guò)程中觀察到了骨的代謝，即骨的形成、吸收和重建過(guò)程，逐漸認(rèn)識(shí)到這種代謝過(guò)程中各種活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),骨生長(zhǎng)因子缺乏或活性不足是延遲骨折愈合及至骨不連接的重要原因。因此,如何促進(jìn)骨折、骨缺損的修復(fù),治療骨不連是骨科領(lǐng)域積極探索的課題。為了進(jìn)一步觀察骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β(TGF-β)的成骨能力及作用機(jī)理,我們用新鮮小牛血小板提取出TGF-β,進(jìn)行骨折治療的實(shí)驗(yàn)研究,為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1血小板蛋白的分離純化以新鮮牛血小板為原料,參照Assioan等的方法,采用酸醇抽提方法,提取血小板蛋白,并先后經(jīng)這兩次BioGelP60柱層析,分離純化,并與標(biāo)準(zhǔn)TGF-β比較,純度達(dá)98.7%。以NRK細(xì)胞和肌內(nèi)包埋,測(cè)定活性,凍干后低溫保存。(方法另發(fā)表)1.2小鼠骨折動(dòng)物模型及注射取昆明小鼠80只,雌雄各半,體重18～20g。每只小鼠右后肢股骨定點(diǎn)制成骨折動(dòng)物模型,并外固定,隨機(jī)分為A、B、C、D四組,每組20只。每日在A、B、C三組小鼠骨折處骨膜下注射藥液25μL,連續(xù)注射10天,D組空白對(duì)照。A組注射TGF-β10μg/d,B組注射5μg/d,C組注射PBS。1.3觀察指標(biāo)1.3.1x線檢查術(shù)后7、14、21天四組動(dòng)物分別在48kV,25mA,0.12S,50cm的投照條件下進(jìn)行X線攝片,以觀察骨折修復(fù)過(guò)程和效果。1.3.2小鼠骨髓礦物的he染色術(shù)后7、14、21天各組隨機(jī)殺死5只實(shí)驗(yàn)小鼠,取下右側(cè)股骨10%甲醛固定,混合脫鈣液脫鈣,逐級(jí)脫水,石蠟包埋,作5μm切片,HE染色,光鏡觀察。1.3.3平均體積密度和數(shù)量密度在HE染色切片上,取外骨痂遠(yuǎn)、中、近3個(gè)視野,利用微機(jī)圖像處理系統(tǒng)處理切片圖像,分別計(jì)算出骨折后7、14、21天骨痂內(nèi)骨生成細(xì)胞、成骨細(xì)胞的體積密度(Vˉvt),平均體積(Vˉv),數(shù)量密度(NˉV),并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1骨折超早期感染的動(dòng)物傷tgf-5g/d術(shù)后14天,A組(TGF-β10μg/d)動(dòng)物右下肢骨折處已有明顯骨性骨痂形成,局部增粗,骨密度較高,骨折線不清,但斷端骨髓腔未通。而B組(TGF-β5μg/d)在骨折處僅見纖維性骨痂,骨痂密度較低,骨折線清楚可見。C組(PBS組)和D組(空白對(duì)照組)動(dòng)物傷肢局部軟組織腫脹明顯,未見有骨痂形成,斷端無(wú)骨連接,骨折線清楚。術(shù)后第21天,A組動(dòng)物傷肢已完全愈合,骨折線消失,斷端骨髓腔再通,骨皮質(zhì)厚度與健側(cè)完全相同。B組動(dòng)物傷肢局部已形成了骨性骨痂,但骨髓腔未通。C組、D組動(dòng)物傷肢局部?jī)H生有大量纖維性骨痂,密度較低,斷端清楚可見,未愈合(圖1～3)。2.2術(shù)后骨部的充填A(yù)組動(dòng)物術(shù)后7天,外骨痂中含有較多的成纖維細(xì)胞和纖維性結(jié)締組織及新生的毛細(xì)血管,骨生成細(xì)胞數(shù)量較多,呈群存在;位于幼稚骨小梁邊緣有眾多呈層排列的成骨細(xì)胞。術(shù)后14天,骨小梁進(jìn)一步成熟,呈網(wǎng)狀或海綿狀,功能活躍的成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與功能活躍的破骨細(xì)胞同期發(fā)揮作用,進(jìn)行內(nèi)外骨痂塑建和改建,部分骨小梁被吸收。術(shù)后21天,內(nèi)外骨痂改建、塑建進(jìn)一步完善,骨髓腔已通,骨折線消失,骨折被修復(fù)。B組動(dòng)物至第三周,內(nèi)外骨痂處于塑建和改建階段,骨髓腔未通。C組、D組在骨折處有大量纖維組織和豐纖維細(xì)胞,僅見大量成骨細(xì)胞,斷端依然明顯。2.3不同時(shí)期內(nèi)骨細(xì)胞的體積密度v.vt、平均體積v.v和數(shù)量密度n的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1和表2所示從表1中可見,骨生長(zhǎng)細(xì)胞Vvt給藥后1～3周對(duì)照組大于實(shí)驗(yàn)組,Vv、Nv第1～3周實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組。3骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-一旦發(fā)生骨折,在斷端部位很快就出現(xiàn)纖維組織增生,血管增加,細(xì)胞分裂,增殖活躍。這種骨的再建過(guò)程受著體內(nèi)多種活性物質(zhì)的調(diào)節(jié),同時(shí)也受著骨和軟骨內(nèi)含有的多種生長(zhǎng)因子的調(diào)控。經(jīng)研究證明,骨和軟骨組織內(nèi)含有的生長(zhǎng)因子,是由骨和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生,并貯存在骨基質(zhì)中,在一定條件下可被釋放或激活。它們作為局部調(diào)節(jié)因子,以自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)著骨和軟骨內(nèi)各種細(xì)胞的增殖與分化,調(diào)節(jié)骨和軟骨基質(zhì)的合成與降解促進(jìn)骨折區(qū)的血液循環(huán)、毛細(xì)血管增生,加強(qiáng)DNA、I型膠原和非膠原合成,刺激骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增生,抑制破骨細(xì)胞性骨吸收,加快骨折或骨缺損的修復(fù)。骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β之所以能發(fā)揮其生物活性,是由于受受體介導(dǎo)的。在骨和軟骨細(xì)胞膜上存在著與各種生長(zhǎng)因子相對(duì)應(yīng)的特異性受體,盡管有些生長(zhǎng)因子有多種形式,但它們都分別作用于各自的一種受體。在骨和軟骨內(nèi),生長(zhǎng)因子受體在細(xì)胞上分布較廣,幾乎所有的細(xì)胞均含有一種或數(shù)種生長(zhǎng)因子的特異性受體。這些受體對(duì)相應(yīng)的生長(zhǎng)因子有高度親合力,當(dāng)血液中某一種生長(zhǎng)因子濃度增加,就會(huì)在相應(yīng)受體介導(dǎo)下到達(dá)受傷處,廣泛參與骨再建的局部調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)骨折修復(fù)。當(dāng)前,將骨生長(zhǎng)因子作為促進(jìn)骨折和骨缺損的修復(fù),用于受累的前成骨細(xì)胞,以加強(qiáng)其增殖及功能恢復(fù),是很有應(yīng)用前景的。據(jù)報(bào)道局部應(yīng)用1