飼料中維生素A的測定 高效液相色譜法 征求意見稿

1GB/T17817－202×飼料中維生素A的測定高效液相色譜法本文件描述了飼料中維生素A的高效液相色譜測定方法。本文件中“第一法皂化提取法”適用于配合飼料、精料補充料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中維生素A的測定；“第二法直接提取法”適用于復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中維生素A乙酸酯的測定。本文件第一法定量限為1000IU/kg，第二法定量限為20000IU/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4第一法皂化提取法4.1原理試樣用堿溶液皂化后，經(jīng)液液萃取或固相萃取凈化后，用高效液相色譜儀分離測定，外標(biāo)法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。4.2.1水：GB/T6682，一級。4.2.2無水乙醇：色譜純。4.2.3石油醚（沸程30℃~60℃)。4.2.4甲醇：色譜純。4.2.5乙腈：色譜純。4.2.6甲酸。4.2.7異丙醇：色譜純。2GB/T17817－202×4.2.8L-抗壞血酸。4.2.9二丁基羥基甲苯（BHT）。4.2.10無水硫酸鈉。4.2.11氫氧化鉀溶液（500g/L稱取500g氫氧化鉀，加水溶解，冷卻后用水定容至1L，混勻。4.2.12乙醇溶液I（70%，體積分?jǐn)?shù)）：量取無水乙醇70mL，用水稀釋，定容至100mL，混勻。4.2.13乙醇溶液II（50%，體積分?jǐn)?shù)）：量取無水乙醇50mL，用水稀釋，定容至100mL，混勻。4.2.14甲醇溶液（10%，體積分?jǐn)?shù)量取甲醇10mL，用水稀釋，定容至100mL，混勻。4.2.15甲酸溶液（0.1%，體積分?jǐn)?shù)）：量取甲酸1mL，用水稀釋，定容至1L，混勻。4.2.16乙醇溶液III（40%，體積分?jǐn)?shù)量取無水乙醇40mL，用水稀釋，定容至100mL，混勻。4.2.17乙腈異丙醇混合溶液（V:V=1:1)：量取50mL乙腈與50mL異丙醇混合均勻。4.2.18維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000IU/mL稱取維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：127-47-9，純度≥95.0%，或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）34和提取（4.5.1.2.1），將石油醚提取液全部濃縮蒸發(fā)至干，用無水乙醇（4.2.2）溶解殘渣，置入100mL棕色容量瓶中并稀釋至刻度，加入100mg二丁基羥基甲苯（BHT）,溶解并混勻后18℃~－20℃避光保存，有效期6個月。臨用前將儲備溶液回溫至室溫，按照附錄A規(guī)定進行濃度校正。4.2.19維生素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.2.18）于100mL棕色容量瓶中，液液萃取法和固相萃取法用無水乙醇（4.2.2）稀釋并定容，混勻；配制成質(zhì)量濃度分別為0.2IU/mL、0.5IU/mL、1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、20IU/mL、50IU/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，臨用現(xiàn)配；在線固相萃取法用乙醇溶液II（4.2.13）稀釋并定容，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.16IU/mL、0.40IU/mL、0.80IU/mL、1.60IU/mL、4.0IU/mL、8.0IU/mL、16.0IU/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，臨用現(xiàn)配。4.2.20酚酞指示劑（10g/L）：稱取1g酚酞，用95%乙醇溶解，并稀釋至100mL，混勻。4.2.21固相萃取柱：填料為聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物1）200mg/6mL，或性能相當(dāng)者。4.2.22在線固相萃取柱：填料為聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，長度為12.5mm，內(nèi)徑為4.6mm，粒徑為15μm～20μm，或性能相當(dāng)者。4.2.23微孔濾膜：孔徑0.2μm，有機系。4.2.24氮氣：純度99.9%。4.3儀器設(shè)備4.3.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。4.3.2紫外可見分光光度計：帶1cm石英比色皿。4.3.3分析天平：精度為0.001g、0.0001g和0.00001g。4.3.4回流裝置：圓底燒瓶和冷凝管。1）文件中給出的淋洗條件和洗脫條件適用于BondElutPlexa萃取小柱和PEP萃取小柱。給出這兩款商品化萃取小柱的信息是為了方便本部分的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認(rèn)可。淋洗條件和洗脫條件允許調(diào)整，建議使用者在使用固相萃取小柱前，先對固相萃取小柱的適用性做出評估。不論何種品牌的固相萃取小柱，在滿足分析目標(biāo)物回收率要求及雜質(zhì)凈化的前提下是可以使用的。3GB/T17817－202×4.3.5恒溫水浴，控溫精度±2℃。4.3.6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.3.7離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。4.3.8固相萃取裝置。4.3.9氮吹儀。4.3.10渦旋混合器。4.4樣品配合飼料、精料補充料、濃縮飼料試樣，按照GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，粉碎使其全部通過1mm孔徑的試驗篩，混合均勻，裝入密閉容器中，2℃~8℃避光保存，盡快測定。復(fù)合預(yù)混合飼料試樣、維生素預(yù)混合飼料試樣裝入密閉容器中，2℃~8℃避光保存，盡快測定。4.5試驗步驟4.5.1試樣溶液的制備4.5.1.1皂化平行做兩份試驗。稱取配合飼料、精料補充料、濃縮飼料10g（精確至0.001g稱取復(fù)合預(yù)混合飼料4g（精確至0.001g維生素預(yù)混合飼料1g（精確至0.0001g）置入250mL圓底燒瓶中，加1g抗壞血酸（4.2.8），0.2gBHT（4.2.9），加入50ml無水乙醇（4.2.2）和20mL50%氫氧化鉀溶液（4.2.11置于沸水浴上回流30min，不時振蕩，防止試樣粘附在瓶壁上，皂化結(jié)束，分別用5mL無水乙醇（3.2.2）、5mL水自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取出燒瓶冷卻至約40℃,備用。4.5.1.2提取凈化4.5.1.2.1液液萃取法將皂化液（4.5.1.1）全部轉(zhuǎn)移至盛有100mL石油醚（4.2.3）的500mL分液漏斗中，用30mL～50mL水分2～3次沖洗圓底燒瓶并入分液漏斗，加蓋、混勻后放氣，激烈靜置、分層。轉(zhuǎn)移水相于另一個分液漏斗中，分次用100mL、60mL石油醚（4.2.3）各提取1次，棄去水相，合并三次石油醚相。用水每次100mL洗滌石油醚（4.2.3）提取液至中性[可用酚酞指示劑(4.2.20)檢測下層溶液，直至無色]，初次水洗時輕輕旋搖，防止乳化。配合飼料、精料補充料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料石油醚提取液經(jīng)約3g無水硫酸鈉（4.2.10）脫水，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶中，在水浴溫度約50℃、一定真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或用氮氣吹干。對于配合飼料、精料補充料、濃縮飼料，吹干后的殘渣用無水乙醇（4.2.2）溶解并稀釋至10mL，取一定體積皂化液于離心管中，調(diào)整離心機轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心5min，或過0.2μm微孔濾膜至進樣瓶中，待測。對于復(fù)合預(yù)混合飼料，吹干后的殘渣用無水乙醇（4.2.2）溶解并稀釋至100mL，取一定體積皂化液于離心管中，調(diào)整離心機轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心5min，或過0.2μm微孔濾4GB/T17817－202×膜至進樣瓶中，待測。對于維生素預(yù)混合飼料石油醚提取液經(jīng)約3g無水硫酸鈉（4.2.10）脫水，轉(zhuǎn)移到250mL棕色容量瓶中，用石油醚（4.2.3）稀釋至刻度，混勻。取一定體積皂化液用無水乙醇（4.2.2）稀釋，過0.2μm微孔濾膜至進樣瓶中，待測。4.5.1.2.2離線固相萃取法將皂化液（4.5.1.1）全部轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用5mL乙醇溶液I（4.2.12）洗滌瓶內(nèi)的殘渣并將溶液并入容量瓶內(nèi)，重復(fù)洗滌兩次，用乙醇溶液I（4.2.12）定容，混勻，取一定體積皂化液于離心管中，5000r/min離心5min，上清液待用。移取3mL甲醇、5mL水分別淋洗、活化固相萃取小柱，棄去淋洗液。對于配合飼料、精料補充料和濃縮飼料皂化上清液，混勻后準(zhǔn)確移取6.0mL，加2mL水，于15mL具塞離心管中渦旋均勻，全部加載到固相萃取柱中，控制流速小于2mL/min,用甲醇溶液（4.2.14）每次2mL，洗滌兩次離心管過柱，再用4mL甲醇溶液（4.2.14）淋洗固相萃取柱。負(fù)壓抽干固相萃取柱，用乙腈（4.2.5）洗脫3次，每次1mL，合并洗脫液，于40℃下用氮氣吹干，準(zhǔn)確加入1mL乙腈（4.2.5），渦旋均勻，過0.2μm微孔濾膜至進樣瓶中，待測。對于復(fù)合預(yù)混合飼料皂化上清液，混勻后準(zhǔn)確移取1.5mL，加0.5mL水，于5mL具塞離心管中渦旋均勻，全部加載到固相萃取柱中，以下淋洗、洗脫步驟同配合飼料、精料補充料和濃縮飼料皂化上清液的淋洗、洗脫步驟，乙腈洗脫液需收集到5mL容量瓶中，并用乙腈（4.2.5）定容，混勻，過0.2μm微孔濾膜至進樣瓶中，待測。4.5.1.2.3在線固相萃取法將配合飼料、精料補充料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料皂化液（4.5.1.1）全部轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中,用適量乙醇水溶液II（4.2.13)洗滌瓶內(nèi)的殘渣并將洗液并入容量瓶內(nèi)，用乙醇水溶液II（4.2.13)定容，混勻，取一定體積皂化液于離心管中，10000r/min離心15min,取適量上清液過0.2μm濾膜至進樣瓶中，待測。4.5.2測定4.5.2.1液相色譜參考條件Ⅰ液相色譜參考條件Ⅰ如下：a）色譜柱：C18型柱，長150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：甲醇（4.2.4）+水=95+5；c）流速：1.0mL/min；d）柱溫：室溫；e）進樣量：20μL；f）檢測波長：325nm。4.5.2.2液相色譜參考條件Ⅱ液相色譜參考條件Ⅱ如下：a）色譜柱：薄殼型C8柱，長度50mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑2.7μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：A相為0.1%甲酸溶液（4.2.15B相為乙腈（4.2.5C相為甲醇（4.2.4梯度洗脫程序見表1；c）柱溫：35℃;5GB/T17817－202×d）進樣量：10μL；e）檢測波長：325nm；表1梯度洗脫程序0000000004.5.2.3液相色譜參考條件Ⅲ液相色譜參考條件Ⅲ見表2，在線固相萃取高效液相色譜儀配置連接參考圖見附錄D。表2液相色譜參考條件ⅢA相為水B相為乙腈（4.2.5）6GB/T17817－202×表3在線固相萃取系統(tǒng)梯度洗脫程序000000表4色譜分離系統(tǒng)梯度洗脫程序004.5.2.4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，根據(jù)選用的試樣溶液制備方法，選取液相色譜參考條件進行測定?！暨x用液液萃取法（4.5.1.2.1），按照液相色譜參考條件Ⅰ（4.5.2.1），分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.19）和試樣溶液（4.5.1.2.1）上機測定，維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄B的圖B.1?！暨x用固相萃取法（4.5.1.2.2按照液相色譜參考條件Ⅰ（4.5.2.1）或Ⅱ（4.5.2.2分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.19）和試樣溶液（4.5.1.2.2）上機測定，維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄B的圖B.2?！暨x用在線固相萃取法（4.5.1.2.3），按照液相色譜參考條件Ⅲ（4.5.2.3），分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.19）和試樣溶液（4.5.1.2.3）上機測定，維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄B的圖B.3。4.5.2.5定性以保留時間定性，試樣溶液中維生素A的保留時間應(yīng)與質(zhì)量濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中維生素A的保留時間一致，其相對偏差在±2.5%之內(nèi)。4.5.2.6定量7GB/T17817－202×以維生素A的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.999。試樣溶液中維生素A的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，若超出線性范圍，應(yīng)將試樣溶液稀釋后，重新測定。單點校準(zhǔn)定量時，試樣溶液中維生素A的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度相差不超過30%。4.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中維生素A的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1計，單位為國際單位每千克（IU/kg）。多點校正按公式（1）計算，單點校正按公式（2）計算：式中：V……ρ1—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中維生素A質(zhì)量濃度，單位為國際單位每毫升（IU/mLV1—提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V3—試樣溶液最終體積，單位為毫升（mL）；n—超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)；m1—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V2—從提取液（V1）中分取的溶液體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)。式中：A1—試樣溶液中維生素A峰面積值；ρs1—標(biāo)準(zhǔn)溶液維生素A質(zhì)量濃度，單位為國際單位每毫升（IU/mLV1—提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V3—試樣溶液最終體積，單位為毫升（mL）；n—超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)；As1—標(biāo)準(zhǔn)溶液中維生素A峰面積值；m1—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V2—從提取液（V1）中分取的溶液體積，單位為毫升（mL）；1000——換算系數(shù)。測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。4.7精密度在重復(fù)性條件下，2次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的百分?jǐn)?shù)，見表5。8GB/T17817－202×表5相對偏差3>1.00×104～1.00×105>1.00×105～1.00×106>1.00×10655第二法直接提取法5.1原理用甲醇溶液提取試樣中的維生素A乙酸酯，高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.1水：GB/T6682一級。5.2.3甲醇：色譜純。5.2.4維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000IU/mL）：稱取維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：127-47-9，純度≥95.0%，或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）34.4mg（精確至0.00001g），于100mL棕色容量瓶中，加入100mg二丁基羥基甲苯（BHT）,用甲醇（5.2.3）溶解并稀釋至刻度，混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后，在－18℃~－20℃避光保存，有效期6個月。臨用前將儲備溶液回溫至室溫，按照附錄A規(guī)定進行濃度校正。5.2.5維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取0.1mL、0.3mL、0.6mL、1.5mL、3mL、6mL維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.2.4分別置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇（5.2.3）稀釋定容，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0IU/mL、3.0IU/mL、6.0IU/mL、15.0IU/mL、30.0IU/mL、60.0IU/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，臨用現(xiàn)配。5.2.6微孔濾膜：孔徑0.45μm，有機系。5.3儀器設(shè)備5.3.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。5.3.2紫外-可見分光光度計：帶1cm石英比色皿。5.3.3分析天平：精度為0.0001g和0.00001g。5.3.4超聲波清洗器：頻率不低于35000Hz。5.4樣品試樣裝入密閉容器中，2℃~8℃避光保存，盡快測定。9GB/T17817－202×5.5試驗步驟5.5.1試樣溶液的制備平行做兩份試驗。稱取復(fù)合預(yù)混合飼料試樣5g~10g（精確至0.001g置于250mL的棕色容量瓶中，維生素預(yù)混合飼料0.5g~1g（精確至0.0001g），置于100mL的棕色容量瓶中，加入約2/3容量瓶體積的甲醇（5.2.3邊加邊搖勻，瓶塞不要擰緊，于超聲波水浴中，在室溫下超聲提取30min，期間振搖1~2次，冷卻至室溫，用甲醇（5.2.3）稀釋至刻度，充分搖勻，取適量溶液過微孔濾膜至進樣瓶中，待測。如果試樣中維生素A乙酸酯的標(biāo)示量高于1000萬IU/kg，則需將溶液用甲醇（5.2.3）進一步稀釋。5.5.2測定5.5.2.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，長度150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：甲醇（5.2.3）+水=（98+2）；c）流速：1.0mL/min；d）溫度：室溫；f）進樣量：20μL；g）檢測波長：325nm。5.5.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.2.5）和試樣溶液（5.5.1）上機測定。維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄C。5.5.2.3定性以保留時間定性，試樣溶液中維生素A乙酸酯色譜峰的保留時間應(yīng)與質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)系列溶液中維生素A乙酸酯色譜峰的保留時間一致，其相對偏差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。5.5.2.4定量以維生素A乙酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.999。試樣溶液中維生素A乙酸酯的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，若超出線性范圍，應(yīng)將試樣溶液用甲醇（5.2.3）稀釋后，重新測定。單點校準(zhǔn)定量時，試樣溶液中維生素A乙酸酯的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度相差不超過30%。5.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中維生素A乙酸酯的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w2計，單位為國際單位每千克（IU/kg）。多點校正按式（3）計算，單點校正按公式（4）計算：2m2………GB/T17817－202×式中：ρ2—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中維生素A乙酸酯濃度，單位為國際單位每毫升（IU/mL）；V—試樣溶液（4.6.1）的總稀釋體積，單位為毫升（mL）；n—超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)；m2—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)；A………………式中：A2—試樣溶液中維生素A乙酸酯峰面積值；ρs2—標(biāo)準(zhǔn)溶液維生素A乙酸酯質(zhì)量濃度，單位為國際單位每毫升（IU/mLV—試樣溶液的總稀釋體積，單位為毫升（mL）；n—超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍后的稀釋倍數(shù)；As2—標(biāo)準(zhǔn)溶液中維生素A乙酸酯峰面積值；m2—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)；平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。5.7精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不超過該算術(shù)平均值的GB/T17817－202×（規(guī)范性）維生素A和維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的質(zhì)量濃度校正方法維生素A和維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制后，在使用前需要對其質(zhì)量濃度進行校正，具體操作如下：a）準(zhǔn)確移取維生素A標(biāo)準(zhǔn)貯儲備溶液（4.2.16）1.0mL，置100mL棕色容量瓶中，用無水乙醇（4.2.2）定容至刻度，混勻，用1cm石英比色皿，以無水乙醇為空白參比，在波長325nm處測定其吸光度；準(zhǔn)確移取維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.2.16）1.0mL，置100mL棕色容量瓶中，按照維生素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.17）規(guī)定的溶液稀釋至刻度。取適量于進樣小瓶中，按照“4.5.2測定”中規(guī)定的色譜參考條件進樣，獲取色譜圖。在色譜圖中，小于維生素A峰面積0.01倍的色譜峰忽略不計，用面積歸一化法計算維生素A峰面積占色譜峰總面積的百分比。維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.2.16）的濃度按公式（A.1）計算：式中：P1——維生素A標(biāo)準(zhǔn)貯儲備溶液，單位為IU/mLA——維生素A儲備稀釋溶液的吸光度值P——面積歸一化法求得的維生素A峰面積占色譜峰總面積的百分比3.