黃瓜‘nc4406’種間雜種f

黃瓜‘nc4406’種間雜種f

0基因型栽培黃瓜的利用【研究意義】在一定程度上，遠緣雜交打破了物種之間的界限，為實現(xiàn)不同物種之間的遺傳傳播、創(chuàng)造物種間的變異并創(chuàng)造新品種提供了新的方法。同時，它為研究生態(tài)系統(tǒng)的親屬關系和系統(tǒng)發(fā)展提供了重要的實驗系統(tǒng)。而對種間雜種F1減數(shù)分裂過程中染色體配對和分離行為以及雌雄配子的發(fā)生、發(fā)育過程的研究,將有助于理解種間雜種F1的遺傳特點、種間親緣關系、雜種可育和敗育機制,同時對指導有效地利用外源有用基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】利用栽培黃瓜(CucumissativusL,2n=14)與野黃瓜(C.hystrixChakr,2n=24)進行正反種間雜交、染色體加倍以及隨后的回交,筆者獲得了一系列特異種質(zhì)資源,如有育性的雙二倍體(C.hytivusChen&Kirkbride,2n=4x=38)、異源三倍體黃瓜(2n=3x=26)和單體異附加系等。但這些研究都僅圍繞著一個基因型的雜交組合(C.hystrixב北京截頭’)進行,而且F1高度不育,只能利用染色體加倍后的雙二倍體轉(zhuǎn)移C.hystrix的有用性狀?！颈狙芯壳腥朦c】為了加快利用野生優(yōu)良性狀進行黃瓜品種改良,筆者最近培育出了多個基因型栽培黃瓜與C.hystrix雜交的種間雜種F1,從中篩選出一個具有部分育性的種間雜種(C.hystrixבNC4406’)。它與栽培黃瓜回交能夠得到少量的種子或幼胚(未發(fā)表資料)。表明這一新基因型種間雜種F1有望直接用于轉(zhuǎn)移C.hystrix的優(yōu)良性狀,如耐低溫弱光、抗霜霉病和枯萎病(未發(fā)表資料)等,為發(fā)掘和利用C.hystrix的有用基因提供新的途徑?！緮M解決的關鍵問題】目前筆者對這一種間雜種F1的認識僅局限于一些田間表現(xiàn)上,對其減數(shù)分裂過程中染色體配對和分離行為以及雌雄配子的發(fā)生、發(fā)育過程缺乏了解。因此本文從雌雄配子發(fā)生和發(fā)育的角度對其進行系統(tǒng)的細胞學研究,旨在為雜種F1中染色體組之間的交換重組以及雌雄配子發(fā)生和發(fā)育特點等提供細胞學證據(jù),并對其育性作出準確評價。1材料和方法1.1生長與馴化以本實驗室最近新合成的并具有部分育性的種間雜種F1(C.hystrixבNC4406’)為試材。2005年3月上旬對該雜種無菌苗進行生根馴化,4月上旬將馴化成活的雜種植株定植于南京農(nóng)業(yè)大學蔬菜實驗地。盛花期取不同大小的雄花蕾(0.2~5mm)和子房(長0.5~4.0cm)分別用于減數(shù)分裂觀察和石蠟切片研究。1.2方法1.2.1熊子出生和發(fā)育過程中的減少數(shù)據(jù)分析1.2.3花粉萌發(fā)、復育、培養(yǎng)雜種F1的育性將通過以下幾種方法測定,(1)0.1%醋酸洋紅染色測定花粉育性,紅色花粉粒代表可育的花粉;(2)花粉萌發(fā)試驗:于上午8:00左右,從10棵雜種植株上采摘當天開放的雄花,隨后將花粉均勻散放在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基含0.8%瓊脂,10%蔗糖和0.05%硼酸),25℃下培養(yǎng)2~3h后統(tǒng)計花粉萌發(fā)率,濕度80%以上。(3)雜種F1雌雄配子育性的活體檢測:將F1(C.hystrixבNC4406’)與栽培黃瓜‘NC4406’進行正反交,根據(jù)正交(C.hystrixבNC4406’)בNC4406’組合的結(jié)實率和結(jié)籽數(shù)判斷雌配子的育性,根據(jù)反交‘NC4406’×(C.hystrixבNC4406’)的結(jié)實率和結(jié)籽數(shù)判斷雄配子的育性。結(jié)實率=結(jié)實的瓜數(shù)/座果瓜數(shù)。2結(jié)果與分析2.1從出生過程中引導雄性后代2.1.1終變期和中期i染色體的同源性雜種F1(C.hystrixבNC4406’)的花粉母細胞在減數(shù)分裂過程中染色體聯(lián)會復雜,幾乎所有的花粉母細胞減數(shù)分裂的行為都表現(xiàn)異常。在雙線期經(jīng)常觀察到3~7條染色體提前凝縮形成短而粗的染色體,表明染色體之間減數(shù)分裂不同步(圖1-A);在終變期和中期I,除觀察到較高頻率(15.6%)的單價體外,還常觀察到1~2個環(huán)狀二價體(圖1-B,C),甚至還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀或鏈狀的三價體和四價體(圖1-D),說明兩個不同來源的染色體組之間存在一定的同源性。中期I染色體構(gòu)型公式為15.6Ⅰ+1.3Ⅱ+0.15Ⅲ+0.07Ⅳ。這些特殊的分裂行為將對雜種F1的花粉母細胞染色體分離以及小孢子的發(fā)育產(chǎn)生影響。2.1.2花粉母細胞的染色體核型由于種間雜種F1的染色體同源性低,花粉母細胞中大多數(shù)染色體不能配對形成二價體,以致未配對的單價體在減數(shù)分裂后期Ⅰ向兩極隨機分離,形成染色體不均等的兩極(圖1-E,F),并且大約有20%的花粉母細胞在后期I出現(xiàn)1至數(shù)條落后的染色體(圖1-G)。其中大部分(約80%)花粉母細胞以13﹕6、11﹕8、12﹕7等方式分離(圖1-E),也有少部分細胞(20%左右)以10﹕9和14﹕5方式分離(圖1-F)。這種不等分裂的結(jié)果將最終形成具有不同染色體數(shù)目的雄配子體。在減數(shù)分裂后期II,花粉母細胞中大部分染色體被再次隨機分向兩極,少數(shù)(1~4條)落后的染色體由于沒能及時到達兩極而被滯留在中央形成1至數(shù)極(圖1-I),結(jié)果形成多極染色體。但也有部分花粉母細胞的染色體先形成3極分布(圖1-H),隨后進一步分裂分布成多極。在減數(shù)分裂末期II,花粉母細胞進一步分裂,四極的染色體和落后的染色體周圍逐漸形成細胞壁,形成不同類型的多分孢子體(表1)。多分孢子體通常由4個體積較大的子細胞和1~6個體積較小的子細胞組成(圖1-J,表1)。統(tǒng)計142個四分體時期的細胞,沒有觀察到四分體細胞,其中以六分體居多,占統(tǒng)計數(shù)的45.3%,其次是七分體和八分體,占34.2%,同時也觀察到其它類型的多分孢子體,如五分體、九分體甚至十二分體等(表1)。2.2花粉粒的發(fā)育多分體在其周圍的胼胝質(zhì)溶解后,不同大小的小孢子(花粉粒)彼此散開。觀察結(jié)果表明,不同大小的花粉粒在隨后的發(fā)育過程中差異很大。部分剛游離出來的、體積較大的單核花粉粒(占總花粉數(shù)的23.3%),細胞壁薄,細胞質(zhì)濃厚,核位于細胞中央,并能看到3個萌孔(圖1-K)。在單核晚期,可明顯看到花粉粒中出現(xiàn)大液泡,細胞核被逐漸擠到一側(cè)(圖1-L),即單核靠邊期。隨后這些花粉粒再經(jīng)歷一次有絲分裂和雙層花粉壁形成等過程,最終發(fā)育成形態(tài)正常并能染上色的成熟花粉粒(圖1-M)。有些花粉粒(15%~20%)雖然體積較大,但沒有萌發(fā)孔,或者只有1個或2個萌發(fā)孔,不能進一步形成正?；ǚ哿?。而那些體積較小的花粉粒,大部分無萌發(fā)孔,少數(shù)只有1個萌發(fā)孔,內(nèi)含物少,它們對醋酸洋紅著色很淺,不能進行小孢子第一次有絲分裂(圖1-M)。根據(jù)小孢子發(fā)育特點和染色反應可判斷這些花粉粒通常在單核期就停止發(fā)育,甚至有些徹底裂成碎片。2.3其它胚囊發(fā)育情況在種間雜種F1的雌配子發(fā)育過程中,除了觀察到以上發(fā)育正常的現(xiàn)象外,筆者還發(fā)現(xiàn)了很多胚囊發(fā)育不正常。經(jīng)觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),只有40%左右的胚囊經(jīng)歷以上正常的發(fā)育途徑。而其它胚囊發(fā)育即使減數(shù)分裂正常,也常出現(xiàn)以下異?，F(xiàn)象,如形成無極性的二核、4核或8核胚囊(圖2-F);有的在4核胚囊之后,分裂形成8核以上的胚囊;也有些胚囊發(fā)育到4核之后,胚囊逐漸解體退化(圖2-F,G)。由于完整的胚囊是由卵器和中央細胞組成,各個胚囊分子都有一定特殊的功能,必須相互協(xié)調(diào)才能承擔起受精的作用,因此雜種C.hystrixבNC4406’的雌配子也只具有部分育性。2.4花粉萌發(fā)率測定觀察了5朵剛開放雄花的花粉可染性和萌發(fā)率發(fā)現(xiàn),雜種F1中成熟花粉的可染率達23.3%,花粉離體萌發(fā)率只有6.5%(表2),而且花粉管伸長不正常,常表現(xiàn)為短縮。在相同培養(yǎng)條件下,其雙親栽培黃瓜‘NC4406’和C.hystrix的花粉萌發(fā)率可分別達75%和70%。表明雜種F1的花粉活性較低。從表2可看出,種間雜種F1與栽培黃瓜NC4406正反回交的結(jié)實率都較低。其中種間雜種F1作父本,栽培黃瓜NC4406作母本回交時,結(jié)實率為33.3%,平均結(jié)籽數(shù)為6.3粒/果,所獲3個結(jié)實的瓜中分別只有12、5和2粒種子。以種間雜種F1作母本回交時,結(jié)實率只有3%,不過平均結(jié)籽數(shù)較高(22.8粒/果),最多的可達48粒/果。這些數(shù)據(jù)表明雜種F1的雌雄配子都具有一定育性,表明種間雜種F1有望直接用于轉(zhuǎn)移野黃瓜的有用性狀。3遠緣雜染的敗育機理由于筆者此前獲得的種間雜種F1高度不育,以致有關Cucumis屬種間雜交的研究和利用多集中于雙二倍體和異源三倍體,而對雜種F1的研究較少,尤其是有關其雌雄配子的細胞學研究。本文利用減數(shù)分裂制片技術和石蠟切片技術相結(jié)合,從雌雄配子發(fā)生、發(fā)育及育性測定的角度,不僅揭示了部分可育的種間雜種C.hystrixבNC4406’雌雄配子發(fā)生、發(fā)育的特點,而且還評價了這一種間雜種在回交轉(zhuǎn)育中的育性。這些研究結(jié)果對指導甜瓜屬遠緣雜交育種及有效地利用雜種F1進行品種改良提供了一定的理論依據(jù)。不少研究者認為遠緣雜種的敗育是由于親本染色體組型差異大,減數(shù)分裂紊亂所致,一般在減數(shù)分裂正常的情況下,正常的小孢子都能發(fā)育成正常的花粉。但筆者在雜種F1的雌配子發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn),有些大孢子母細胞即使減數(shù)分裂正常,在隨后的胚囊發(fā)育過程也可能出現(xiàn)敗育;而且不同基因型組合的正反交雜種F1的育性也不一樣。這表明Cucumis屬種間雜種的雌雄配子的敗育不僅和減數(shù)分裂異常有關,而且還可能與其它相關基因的表達調(diào)控有關,這與小麥屬和煙草雄配子發(fā)育的研究結(jié)果相似。因此,植物遠緣雌雄配子發(fā)育和敗育過程的機理較為復雜,還有待于進一步研究。種間雜種C.hystrixבNC4406’減數(shù)分裂過程中所具有的各種特殊的染色體行為(如二價體、多價體和染色體橋等)證明其染色體組之間發(fā)生了廣泛的交換和重組。而經(jīng)交換重組后形成的部分配子可通過回交得以傳遞,這對以這一種間雜種F1為橋梁材料轉(zhuǎn)移野生種外源基因進行黃瓜品種改良具有重大意義。此外,較低頻率的二價體出現(xiàn)表明C.hystrix和栽培黃瓜的親緣關系較遠,與筆者此前有關報道一致。種間雜種C.hystrixבNC4406’減數(shù)分裂過程中常出現(xiàn)染色體分裂不同步,如雙線期中部分染色體提前凝縮、后期I至后期II的落后染色體及染色體橋等。這可能是由于雙親細胞分裂周期不同的緣故所致。這一研究結(jié)果將有助于解釋黃瓜C.hystrix單體異附加系中外源染色體在離體保存條件下都很容易丟失的問題(未發(fā)表資料),也將有助于開展Cucumis屬物種演變、進化等研究。這還有待通過利用基因組原位雜交(genomeinsituhybridization,GISH)等技術進一步深入研究。4cucumis屬種間親緣關系和物種進化的機制種間雜種C.hystrixבNC4406’有部分配子發(fā)育正常,并具有授粉受精能力,說明種間雜種F1的育性和親本的基因型有關。對該種間雜種減數(shù)分裂過程的觀察,發(fā)現(xiàn)野黃瓜與栽培黃瓜之間的染色體組發(fā)生了廣泛的交換和重組,表明其能夠在轉(zhuǎn)導野黃瓜有用性狀改良黃瓜中發(fā)揮作用。此外,本文在減數(shù)分裂過程中觀察到的各種特殊的染色體行為(如多價體和染色體橋等)為進一步闡述Cucumis屬種間親緣關系和物種進化奠定了細胞學基礎。減數(shù)分裂染色體制片按筆者此前的方法進行。于2005年5月中旬取雜種F1(C.hystrixבNC4406’)的不同大小花蕾(0.2~5mm),卡諾固定液處理24h后轉(zhuǎn)入70%酒精備用。顯微觀察時,將花藥從中部橫切,用鑷子輕輕擠壓出花粉母細胞或花粉粒,用卡寶品紅(脫色堿性品紅)染色,采用火焰微烤和45%醋酸分色制片,Olympus(BX-51)顯微鏡觀察照相。1.2.2種間雜體的細胞發(fā)育情況將雜種F1大小不同的子房固定于FAA固定液中備用,真空抽氣30min,經(jīng)過浸洗、脫水、透明、滲臘、包埋、切片(厚度為8μm)、干片(烤片)、脫蠟、鐵釩-蘇木精-固綠對染、脫水、透明、中性樹膠封片,Olympus(BX-51)顯微鏡觀察照相。在種間雜種F15~10mm長的子房中,大孢子母細胞經(jīng)2次減數(shù)分裂后形成呈線性排列的四分體(圖2-A)。四分體中近珠孔端的3個細胞逐漸退化、消