參麥注射液對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠il-18表達(dá)的影響

參麥注射液對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠il-18表達(dá)的影響

在新生兒缺氧缺血性腦病的治療中，復(fù)方丹參作為一種中藥被廣泛使用。張春等人的研究表明，如果同時(shí)使用復(fù)方丹參，可以預(yù)防新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)生和發(fā)展，并有效控制隨后的注射損傷。但由于早期腦室出血，不能使用。參麥注射液能對(duì)抗炎癥時(shí)毛細(xì)血管通透性的升高,提高應(yīng)激時(shí)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的水平,具有明顯的抗炎抗腦水腫作用,提高機(jī)體耐缺氧和抗應(yīng)激能力,故已被應(yīng)用于新生兒缺氧缺血性腦病的治療中。筆者通過參麥注射液干預(yù)新生大鼠HIBD模型,檢測(cè)其對(duì)IL-18表達(dá)的影響,從分子水平探討SMI對(duì)缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組新生7日齡SD大鼠,體重12～16g,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。8%O2/92%N2(上海特種氣體廠);IL-18、IL-18BP進(jìn)口分裝試劑盒(美國RB公司);IL-18免疫組化試劑盒(武漢博士德公司);參麥注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司,批號(hào):Z51021879);常壓缺氧艙(上海市兒科研究所);磷酸鹽緩沖液(自制)。模型制作參照Rice法,新生7日齡SD大鼠用無水乙醚吸入麻醉(0.5～1.0min)后,結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,吸入8%O2、92%N2的混合氣體,氣流量為0.5L/min,持續(xù)2h。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S)、生理鹽水對(duì)照組(C)、參麥預(yù)處理組(P)、參麥治療組(SM)。每組按術(shù)后觀察的時(shí)間點(diǎn)不同分為7個(gè)亞組。參麥預(yù)處理組在缺氧缺血前連續(xù)4天腹腔注射SMI10ml·kg-1·d-1。參麥治療組于缺氧缺血(HI)后立即腹腔注射SMI10ml·kg-1·d-1,在HI后7天內(nèi),按觀察時(shí)間連續(xù)用藥直至7天。生理鹽水對(duì)照組生理鹽水用法同SM組。1.2.2免疫組化pv法檢測(cè)il-18、il-18bp的表達(dá)1.2.2.1觀察新生7日齡SD大鼠腦缺氧缺血后的行為改變。1.2.2.2各組動(dòng)物在處死時(shí)間點(diǎn)用乙醚麻醉后開胸暴露心臟,主動(dòng)脈插管,先用冷生理鹽水20ml/kg快速?zèng)_洗血液,然后取腦。大體觀察腦外形后,立即切取大腦額頂葉小塊腦組織及下丘腦約5mg左右,手工制備成組織勻漿,低溫低速離心(3000r/min)10～15min,留取上清液,-70℃保存?zhèn)錂z。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)IL-18、IL-18BP,經(jīng)酶標(biāo)儀在450nm處讀取OD值,并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出每一樣品的濃度值。1.2.2.3腦組織標(biāo)本保存于10%甲醛溶液中24h后,沿視交叉處垂直切取5mm3的腦組織,常規(guī)石蠟包埋,HarrisHE染色、切片機(jī)切成4～5μm的石蠟切片,取2張切片行HarrisHE染色后觀察。1.2.2.4取5張腦組織石蠟切片免疫組化PV法染色后在光鏡下做缺氧缺血側(cè)IL-18表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)測(cè)定。具體步驟如下:①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,滴加3%H2O25min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶;②加入PBS微波修復(fù)抗原8min,其中高火1.5min,低火6.5min后自然冷卻至室溫;③0.01mol/LPBS沖洗5min;④滴加稀釋度為1∶100的小鼠抗大鼠IL-18單克隆抗體,37℃孵育60min;PBS沖洗5min×3次;⑤滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃孵育15min,PBS沖洗5min×3次,DAB顯色劑呈色,光鏡下觀察呈色程度、控制呈色時(shí)間,背景為淡黃色,陽性細(xì)胞染棕褐色時(shí)終止染色,梯度脫水、中性樹脂封片。以0.01mol/LPBS替代一抗作為陰性對(duì)照。所有的免疫組化玻片均作陽性細(xì)胞記數(shù),每張切片選取5個(gè)視野,求出平均值。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。所有數(shù)據(jù)SPSS13.0軟件分析處理,各組間比較采用單因素方差分析(S-N-K法)。2各組大鼠腦皮質(zhì)、紋狀體及il-18的變化情況缺氧10min大鼠煩躁不安,爬行時(shí)左側(cè)后肢呈拖步,尾巴左翹。缺氧10～20min出現(xiàn)呼吸頻率增加,深大呼吸,頭部抖動(dòng),全身皮膚發(fā)紺。缺氧20～30min出現(xiàn)陣發(fā)性抽搐,部分出現(xiàn)向左側(cè)翻滾運(yùn)動(dòng)。缺氧40～60min出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少,缺氧1h后出現(xiàn)嗜睡或易激惹。缺氧缺血組復(fù)氧后表現(xiàn)為左側(cè)后肢呈拖步,爬行時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)的轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)。軀體平衡能力差,部分呈嗜睡狀態(tài)。假手術(shù)組在任何時(shí)間點(diǎn)腦組織結(jié)構(gòu)層次均清晰、細(xì)胞輪廓正常、核居中、核仁清楚(見圖1)。生理鹽水對(duì)照組缺氧后3h左側(cè)大腦皮質(zhì)、紋狀體出現(xiàn)局灶性神經(jīng)元核固縮(見圖2)。12h可見腦皮質(zhì)、紋狀體病灶增大、數(shù)量增多,可見炎性細(xì)胞局灶性及彌漫性浸潤,24h病變最嚴(yán)重,大腦皮質(zhì)、紋狀體及海馬等部位出現(xiàn)大片壞死、細(xì)胞溶解消失(見圖3、圖4)。3天病灶周圍開始出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生、病灶中心仍可見大量的固縮核和核碎片,7天病灶中心僅見極少量的固縮核,周圍增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞較3天增多,14、28天神經(jīng)元大量丟失,皮層、紋狀體等部位形成疤痕。與S組相比,C組、P組、SM組在12、24h,3、7、14天均有明顯差異(P<0.01),而3h、28天無明顯差異(P>0.05);C組與P組、SM組比較在12、24h、3、7、14天有顯著差異(P<0.01),而3h、28天無明顯差異(P>0.05);P組與SM組比較則在3、12、24h,3、7、14、28天均無明顯差異(P>0.05)。IL-18在各組均為12h開始上升,3天達(dá)高峰,7天開始下降,28天則基本恢復(fù)正常。見表1。與S組相比,C組、P組、SM組IL-18陽性細(xì)胞數(shù)在12、24h,3、7、14、28天均有明顯差異(P<0.01),而3h無明顯差異(P>0.05);C組與P組、SM組比較在12、24h,3、7、14、28天均有明顯差異(P<0.01,P<0.05);P組與SM組比較則在12、24h,3、7、14、28天均無明顯差異(P>0.05)。表達(dá)IL-18的陽性細(xì)胞數(shù)在各組均為12h開始上升,3天達(dá)高峰,7天開始下降,28天仍可見左側(cè)大腦半球IL-18的免疫反應(yīng)。見表2。3預(yù)處理對(duì)新生兒腦缺氧活檢的作用IL-18是由Okamura等在1995年從中毒性休克的小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子,在正常情況下機(jī)體不分泌,在IL-1、TNF-α、IL-6、LPS、外毒素等作用下,IL-18由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝臟Kuffer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等分泌,并產(chǎn)生無活性的IL-18前體形式。經(jīng)IL-1β轉(zhuǎn)化酶在冬氨酸(Asp-x)位點(diǎn)切去前導(dǎo)序列后,才使無活性的IL-18前體裂解成有活性的IL-18而發(fā)揮生物學(xué)作用。Hedtjarn等學(xué)者報(bào)道,在新生鼠腦缺氧缺血模型中,IL-18對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活起主要作用,而小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,可產(chǎn)生毒性作用,參與HIBD的發(fā)病過程。他們采用了Western印跡、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、反轉(zhuǎn)錄PCR等一系列試驗(yàn)方法,得出以下結(jié)果:在新生鼠腦缺氧缺血再灌注損傷后12hIL-18開始升高,并持續(xù)升高24～72h。且新生鼠腦組織缺氧缺血后第3天和第6天,活性IL-18分別增加了70%和36%。經(jīng)雙標(biāo)記免疫熒光測(cè)定為小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,提示腦缺氧缺血后小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活,使IL-18分泌增加參與其病理損傷過程。蔡文萍、王禮周等研究表明,在新生兒HIE中IL-18水平越高,腦組織損傷越嚴(yán)重。故IL-18作為促損傷因子的表達(dá)與病情有關(guān)。參麥注射液是由人參和麥冬經(jīng)超慮法和水純法制成的純中藥制劑,其有效成分為人參皂甙、麥冬皂甙、麥冬黃酮及微量人參多糖、麥冬多糖。它具有調(diào)整中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、抗驚厥、興奮呼吸、強(qiáng)心升壓作用,同時(shí)還有“適應(yīng)原”樣作用,能調(diào)節(jié)免疫功能、退黃降酶等。程基焱等研究表明參麥注射液對(duì)缺血性腦損傷中神經(jīng)元有保護(hù)作用。本研究通過參麥注射液干預(yù)治療新生鼠HIBD模型,結(jié)果顯示在HI后12hIL-18開始上升,3天達(dá)高峰,7天開始下降,28天則基本恢復(fù)正常,且在12、24h,3、7、14天5個(gè)亞組,參麥預(yù)處理組和治療組IL-18的水平明顯低于生理鹽水對(duì)照組,而預(yù)處理組與治療組相比無明顯差異。在HE染色切片中,生理鹽水對(duì)照組可見腦組織結(jié)構(gòu)層次紊亂﹑炎細(xì)胞局灶性浸潤;3天可見大腦皮質(zhì)、紋狀體及海馬等部位出現(xiàn)大片壞死、細(xì)胞溶解消失;14﹑28天神經(jīng)元大量丟失,皮層、紋狀體等部位形成疤痕。而預(yù)處理組與治療組各時(shí)間段腦組織結(jié)構(gòu)層次均清晰、細(xì)胞輪廓正常、核居中、核仁清楚;僅有少量神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮。故IL-18作為促炎性細(xì)胞因子與腦組織損傷有關(guān),且IL-18水平越高,腦組織的損傷越嚴(yán)重。參麥注射液可顯著降低IL-18的表達(dá),從而顯示了對(duì)缺氧缺血性腦組織的保護(hù)作用,預(yù)處理組與治療組相比無明顯差異