第六章酶活性調(diào)控

第六章:酶活性的調(diào)控及化學(xué)修飾6.1引言酶作為生物催化劑，其活性在體內(nèi)是受到調(diào)控的。調(diào)控方式：1）酶活性調(diào)控2）酶濃度調(diào)控活性調(diào)控

1）通過配體的可逆結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象改變來調(diào)控酶的活性。

2）通過酶分子共價(jià)結(jié)合可逆或不可逆改變來調(diào)控酶的活性?；瘜W(xué)修飾的必要性(1)穩(wěn)定性(2)作用的最適條件

酶反應(yīng)是在基本接近中性，與室溫相差不大的水溶液中進(jìn)行的。但在工業(yè)應(yīng)用上，由于產(chǎn)物、底物的影響，作用時(shí)的pH常常不在中性范圍內(nèi)。溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快，但酶往往不穩(wěn)定，如果降低溫度，不但影響反應(yīng)速度，還會(huì)導(dǎo)致微生物的污染．遇到底物不溶于水時(shí)，酶就更難發(fā)揮作用了．(3)酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)

米氏常數(shù)(Km)值過大，通常使反應(yīng)不能在低底物濃度下進(jìn)行。(4)臨床應(yīng)用的特殊要求

當(dāng)前應(yīng)用中的絕大多數(shù)酶皆來自動(dòng)、植物及微生物，對(duì)人體來說這些酶都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，都臺(tái)可能引起人體的過敏反應(yīng)。6.2活性調(diào)控－、通過配體誘導(dǎo)酶構(gòu)象改變的活性調(diào)節(jié)酶分子與配體可逆非共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象的改變，進(jìn)而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)，這類酶稱為變構(gòu)酶。配體酶酶單配體結(jié)合正協(xié)同：配體與酶的結(jié)合增強(qiáng)了酶結(jié)合底物的能力，使酶的活性增加。負(fù)協(xié)同：配體與酶的結(jié)合減弱了酶結(jié)合底物的能力，使酶的活性減少。多配體結(jié)合協(xié)同性：兩個(gè)以上配體存在時(shí),彼此存在相互作用。正協(xié)同性：先結(jié)合的配體，增強(qiáng)了后結(jié)合配體的結(jié)合能力。負(fù)協(xié)同性：先結(jié)合的配體，減弱了后結(jié)合配體的結(jié)合能力。同種協(xié)同性：先結(jié)合的配體影響的是同種配體的結(jié)合能力。異種協(xié)同性：先結(jié)合的配體影響的是其它配體的結(jié)合能力。二、通過酶共價(jià)結(jié)構(gòu)改變的活性調(diào)節(jié)共價(jià)結(jié)構(gòu)不可逆改變的活性調(diào)節(jié)：酶原

活性酶共價(jià)結(jié)構(gòu)可逆改變的活性調(diào)節(jié)許多酶以2種不同催化性能的形式存在，在其它酶的作用下能互相轉(zhuǎn)變。研究酶活性調(diào)控的意義例端粒酶的研究真核生物的染色體末端具有DNA2蛋白質(zhì)復(fù)合的復(fù)雜結(jié)構(gòu),即端粒。在脊椎動(dòng)物,端粒(telomere)包括(TTAGGG)n的重復(fù)序列。此重復(fù)序列的合成是由一種逆轉(zhuǎn)錄酶—端粒酶(telomerase)完成的。如果缺乏端粒酶活性,由于DNA聚合酶不能完整復(fù)制線型的DNA末端,端粒將會(huì)在每次細(xì)胞分裂后喪失一部分5′DNA;累積的端?？s短會(huì)造成細(xì)胞增殖速度的減慢,乃至衰老。轉(zhuǎn)染端粒酶催化亞基至人正常體細(xì)胞,則其端粒長度的維持作用使細(xì)胞保持表型的年輕狀態(tài)。抑癌基因突變的細(xì)胞中,若端粒酶過度激活,則可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)展。6.3化學(xué)修飾一、核酸水平利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)(一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu))更為合理的酶蛋白。二、蛋白質(zhì)水平這個(gè)水平的工作比核酸水平更為直接，因此研究得也比較多。人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除、使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基的修飾，即酶的化學(xué)修飾。6.3.1簡述定義：在分子水平上對(duì)酶進(jìn)行改造，即在體外將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。Lansteiner和VanderScheer及Sela為了消除某些蛋白質(zhì)的抗原性，用聚氨基酸修飾了這些蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其抗原性顯著降低。50年代末到60年代，人們致力于用小分子化合物修飾酶分子中的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)來研究一些酶的活性基團(tuán)的情況。較早用大分子物質(zhì)修飾酶的是Katchalsko等。他們先后用多肽、乙烯二酸酐共聚體和DEAE—右旋糖酐等修飾了酶，使酶的性質(zhì)得到了改善。從70年代開始，研究的普遍開展.6.3.2酶化學(xué)修飾的基本原理一、增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性酶多肽鏈通過一定的方式互相折疊形成了高級(jí)結(jié)構(gòu)即天然構(gòu)象。這種天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與酶分子上許多基團(tuán)間相互作用所產(chǎn)生的能量(焓)和酶分子的無序程度(熵)有關(guān)。酶失活主要是因?yàn)槊阜肿觾?nèi)基團(tuán)間的相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，原先的平衡力受到了破壞于是酶分子天然構(gòu)象就向熱力學(xué)上熵位高方向變化，即從緊密有序趨于隨機(jī)松散，折疊結(jié)構(gòu)打開，最終導(dǎo)致了酶催化功能的喪失。酶化學(xué)修飾通過路酶與修飾劑交聯(lián)后，就可能使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，并同時(shí)減小酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性．二、保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑酶一般是分子量1萬以上的大分子物質(zhì)，而發(fā)揮催化功能的活性部位只是整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)中的一部分。組成活性部位的氨基酸殘基在酶分子的天然構(gòu)象中十分接近，能夠直接與底物結(jié)合，并有利于基團(tuán)間的化學(xué)鍵發(fā)生變化，生成產(chǎn)物。酶活性部位包括與維持活性部位穩(wěn)定性有關(guān)的基團(tuán)的任何變化都會(huì)影響到酶的催化功能。酶抑制劑常常是通過作用于酶活性部位來降低酶催化能力的，阻斷抑制劑與酶的結(jié)合是防止酶活被抑制的關(guān)鍵。酶經(jīng)過化學(xué)修飾共價(jià)交聯(lián)上大分子修飾劑，大分子修飾劑所產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力就可能有效地阻擋抑制劑對(duì)酶的進(jìn)攻，同時(shí)“遮蓋”保護(hù)酶活性部位，使抑制劑和酶活性部位結(jié)合的難度增加，使酶的抗抑制劑能力增強(qiáng)。三、維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶根據(jù)蛋白水解酶是—大分子物質(zhì)，并只是在充分接近多肽鏈上敏感鍵和敏感基團(tuán)后才能產(chǎn)生作用的原理，酶化學(xué)修飾期望交聯(lián)于酶上的大分子修飾劑能產(chǎn)生空間障礙來阻擋蛋白水解酶接近酶分子，能“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。另外，酶分子上許多敏感基團(tuán)(如賴氨酸的ε氨基等)參與修飾反應(yīng)，交聯(lián)上修飾劑后，也減少了酶分子遭受蛋白水解酶攻擊破壞的可能性。四、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后，就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，抗原—抗體反應(yīng)不但能使酶失活，且會(huì)對(duì)人體造成傷害及危險(xiǎn)，但是，通過酶化學(xué)修飾，有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價(jià)鍵，這樣就可能破壞了酶分子上抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶的抗原性降低乃至消除。同時(shí)大分子修飾劑也同樣能“遮蓋”抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)．由于酶分子表面外形的不規(guī)則、各原子間極性和電荷的不同、各氫基酸殘基間相互作用等結(jié)果，使酶分子結(jié)構(gòu)的局部形成了一種微環(huán)境(酶活性部位就是處于微環(huán)境中)。這種微環(huán)境可以是極性的，也可以是非極性的，但都直接影響著酶活性部位氨基酸殘基的電離狀態(tài)，為它們發(fā)揮作用提供了合適的條件。酶微環(huán)境的改變會(huì)對(duì)酶催化功能產(chǎn)生直接影響，例如許多酶在極端pH條件下都很快地、不可逆地失活。酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，除了能減少由于內(nèi)部平衡力被破壞而引起的酶分子伸展打開外，還由于大分子修飾劑本身就是多聚電荷體，所以有可能在酶分子表面形成一層“緩沖外殼”，在—定程度上抵御外界環(huán)境的電荷、極性變化，維持酶活性部位的微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，使酶能在更廣泛的條件下發(fā)揮作用。6.3.3酶化學(xué)修飾的方法及修飾劑利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，或直接或經(jīng)過一定的話化過程與酶分子上某種氨基酸戰(zhàn)基(—般盡量選擇非酶活必需基團(tuán))產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造．一、修飾劑的要求(1)修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性；(2)修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置，(3)修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。一般情況下，要求修飾劑具有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長。二、酶性質(zhì)的了解(1)酶活性部位情況；(2)酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件；(3)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。三、反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)一般總是盡可能在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡量少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)．反應(yīng)的最終結(jié)果是要得到酶和修飾劑的高結(jié)合率及高酶活回收率。因此選樣反應(yīng)條件時(shí)要注意：(1)反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例；(2)反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件；(3)反應(yīng)溫度及時(shí)間。四、常用的修飾劑和修飾方法。1糖及糖的衍生物(一)右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯(DextranandDextranSulphate)右旋糖酐是由α葡萄糖通過α—1，6糖苷鍵形成的高分子多糖．具有較好的水溶性和生物相容性，可用作代血漿，右旋糖酐硫酸酯是多糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基與硫酸成脂而得。多糖鏈上的雙羥基結(jié)構(gòu)經(jīng)活化后可與酶分子上自由氨基結(jié)合。(1)溴化氰法（2）高碘酸氧化法(二)糖肽(GIycopeptide)糖肽一般是通過纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解人纖維蛋白或γ—球蛋白而得。由于糖肽結(jié)構(gòu)上含有氨基，所以經(jīng)活化后能與酶分子上氨基反應(yīng)而產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。(1)異氰酸法糖肽在低溫條件下用2，3—異氰酸甲苯活化，再在堿性條件與酶交聯(lián)．(2)戊二醛法用雙功能試劑戊二醛將搪肽的氨基活化，然后與酶分于上氨基反應(yīng)生成修飾酶。(三）葡聚糖凝膠G—25(SehadexG—25)葡聚糖凝膠是用交聯(lián)劑將葡聚糖長鏈聯(lián)接而成的多孔網(wǎng)狀大分子化合物。選用溶漲狀態(tài)下的sePhadexG—25，用高碘酸在pH4條件下將葡萄糖氧化開環(huán)后，能與酶反應(yīng)產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。通過控制反應(yīng)體系中高碘酸的用量和活化反應(yīng)時(shí)間得到不同活化程度的sephadexG—25，由于它們?cè)谏矬w內(nèi)溶解速度不同，可使酶逐步釋放出來。(四)、聚乳糖(PoIylactose)用聚乳糖作為修飾劑，在一定溫度條件下，通過適當(dāng)?shù)倪€原劑與酶分子上氨基反應(yīng)后，可得到表面乳糖化的修飾酶。2聚乙二醇(PoIyethyleneGlycoI，PEG)聚乙二醇是線性分子，具有較好的生物相容性。聚乙二醇在體內(nèi)不殘留、無毒性和抗原性、它的末端羥基經(jīng)活化后可與酶反應(yīng)，產(chǎn)生交聯(lián)。聚乙二醇修飾酶的顯著優(yōu)點(diǎn)是能消除酶的抗原性。但修飾后往往會(huì)降低酶活性。3合成大分子多聚物目前用于酶化學(xué)修飾的合成大分子主要是以乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、丁烯酸、丙烯酸、乙烯乙酸、丁烯二酸等為單體經(jīng)過單聚或共聚而成。例：聚順丁烯二酸酐。常用分子量為98,000的聚順丁烯二酸酐作為修飾劑，直接與酶分子上氨基反應(yīng)生成修飾酶．4具有生物活性的大分子物質(zhì)肝素是一種含硫酸酯的粘多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量20,000左右．共價(jià)交聯(lián)于酶后可增加酶