家兔kap61基因的序列分析

家兔kap61基因的序列分析

對于動物來說，毛發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。許多研究的目標(biāo)是確定影響動物毛質(zhì)異質(zhì)特性的基因（kaps）。角蛋白相關(guān)蛋白（角蛋白相關(guān)蛋白）作為動物毛發(fā)的基本成員，在毛發(fā)的性質(zhì)上發(fā)揮著重要作用。kap家族分為三類：一類是高含量氨基酸含量（高含量氨基酸含量），由kap6.n和kap7編碼。其中之一是高硫蛋白（高含量氨基酸含量），由kap1.n、kap2.n和kap3.n編碼。另一個是高硫蛋白kap（u型遺傳改良），由kap4.n和kap5.n多基因編碼。大多數(shù)基因?qū)儆谛《危笮?.6.1.5kg，并且不含特定的領(lǐng)養(yǎng)兒童。目前已經(jīng)證明了KAP基因家族在染色體上是成簇存在的,高甘氨酸/酪氨酸KAP6、KAP7和KAP8連鎖在一起,而高甘氨酸/酪氨酸KAP又是羊毛中首先表達(dá)的蛋白,因此,筆者認(rèn)為高甘氨酸/酪氨酸KAP6、KAP7和KAP8對動物毛發(fā)的性質(zhì)可能有比較大的影響.目前,關(guān)于KAP基因家族的研究主要集中于人、羊,而對家兔KAP基因的研究少見報道.本研究以6個家兔群體為試驗材料,獲得家兔KAP6.1基因CDS序列,并進(jìn)行遺傳變異檢測,旨在為進(jìn)一步探討該基因能否作為家兔毛質(zhì)性狀的候選基因提供理論依據(jù).1材料和方法1.1不同兔種的來源選取6個群體共718只家兔為試驗材料,其中,福建黑兔(60只)來自于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;有色獺兔(143只)和白色獺兔(101只)均來自于浙江余姚兔場;九嶷山兔(72只)來自于湖南九嶷山;皖系長毛兔(209只)來自于江蘇宜興拉必得種兔場;蘇系長毛兔(133只)來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院.1.2方法所有個體均為隨機(jī)抽樣,耳緣靜脈采血5mL,采用酚/氯仿法提取總DNA.1.2.1pcr引物的合成根據(jù)GeneBank中家兔KAP6.1基因(AccessionNo.M95718.1)序列,設(shè)計并合成了2對特異性較好的PCR引物,對家兔KAP6.1基因的全CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增,并用于PCR-SSCP檢測.引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物信息見表1.1.2.2sscp檢測和sscp-pcr擴(kuò)增PCR擴(kuò)增總體積為20μL:1μLDNA模板(100ng/μL),2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTP(10mmol/L),上下游引物各1μL(10pmol/μL),Taq酶為0.2μL(5U/μL),ddH2O13.3μL.PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min,94℃變性40s,適宜退火溫度40s,72℃延伸40s,35個循環(huán),最后72℃延伸10min.經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測后,產(chǎn)物用于SSCP檢測.2.5μLPCR產(chǎn)物和7μL變性液,98℃變性10min,冰浴8min.10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acr∶Bis=39∶1),120V電泳14~16h,銀染顯色,根據(jù)其多態(tài)性進(jìn)行分型.選取不同基因型的純合子進(jìn)行切膠回收,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序.試驗所用的DNA聚合酶和dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司.1.2.3基因型分布差異卡方檢驗和位點篩查統(tǒng)計基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、期望雜合度(He),并對各群體基因型分布差異進(jìn)行卡方檢驗,Align軟件進(jìn)行序列比對和SNP位點篩查.2結(jié)果與分析2.1基于序列的kap6.1基因序列及同源性分析用設(shè)計的2對引物擴(kuò)增家兔KAP6.1基因,2%瓊脂糖電泳檢測,擴(kuò)增片段長度與預(yù)期片段大小一致,且特異性較好,經(jīng)雙向測序和序列拼接,獲得2條家兔KAP6.1基因序列,分別為585bp和584bp,包括全部的CDS區(qū)237bp,該序列與人、小鼠、綿羊、山羊的KAP6.1基因的同源性分別為91%、90%、83%和80%.現(xiàn)已將該序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(HM068868和HM068869).2.2gly-tyr-tlygly-t高效價多態(tài)性測序結(jié)果KAP6.1-1座位的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測后,獲得3種基因型(AA、AB、BB型),試驗結(jié)果見圖1,而KAP6.1-2座位未檢測出多態(tài).KAP6.1-1座位的測序結(jié)果,相對于GeneBank上原序列而言,均在675、689、692、711和792位點處有5處插入(圖2).同時,KAP6.1-1座位存在的2個等位基因中,A基因型相對于B基因型在原序列的694位點上有1個插入(G),并且發(fā)生G744C和A755G突變(圖3、4).KAP6.1-2座位的測序結(jié)果相對于原序列的1036-1041位點均存在6個堿基的缺失(圖5),原序列所編碼的氨基酸為Gly-Tyr-Tly(ggctatggt),而本研究中為Gly(ggt).2.3個品種基因型的分布所檢測的群體中,3種基因型只在福建黑兔和九嶷山兔群體中同時被發(fā)現(xiàn),有色獺兔和白色獺兔群體均只檢測到AA、AB基因型,而皖系長毛兔和蘇系長毛兔群體均只檢測到AA基因型,且6個家兔群體均處于哈代-溫伯格平衡(表2).福建黑兔的期望雜合度和多態(tài)信息含量最高,分別為0.339和0.281,表現(xiàn)為中度多態(tài),其他群體均為低度多態(tài)或未發(fā)現(xiàn)多態(tài).福建黑兔與九嶷山兔,有色獺兔與白色獺兔,皖系長毛兔與蘇系長毛兔之間的不同基因型分布差異不顯著(P>0.05),而其他家兔群體彼此間的不同基因型分布存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)(表3).以下為測序結(jié)果與GenBank中序列比對的結(jié)果(圖6),6-1-1-F、6-1-1-R、6-1-2-F、6-1-2-R分別代表2對引物的上下游序列,A、B為不同基因型測序拼接結(jié)果.根據(jù)NCBI中對該基因序列特點的描述,本試驗所擴(kuò)增的5′調(diào)控區(qū)序列包括(見以下consensus序列):CAAT盒(733-736),增強(qiáng)子(749-757),CACCC盒(760-764),TATA盒(777-780).A755G突變處于該基因的增強(qiáng)子區(qū)域.3u3000kis對kap6.1和kap7基因表達(dá)的影響對家兔的KAP6.1基因的全長CDS進(jìn)行了SSCP檢測,所獲得的序列經(jīng)GeneBank比對,與人、小鼠、綿羊、山羊等KAP6.1基因的同源性均達(dá)80%以上,說明該基因在不同物種中的同源性較高,在進(jìn)化過程中比較保守.張亞妮等發(fā)現(xiàn),KAP6.1基因可以作為絨山羊產(chǎn)絨性狀的候選基因.劉桂芬等選擇KAP6.1基因的外顯子區(qū)作為羊毛細(xì)度性狀的候選基因,研究結(jié)果表明KAP6.1基因與羊毛細(xì)度顯著相關(guān).趙俊星等發(fā)現(xiàn)KAP6.1基因在遼寧絨山羊皮膚的表達(dá)量是岢嵐當(dāng)?shù)厣窖虮磉_(dá)量的1.3倍.綿羊和人KAP6和KAP8家族成員的表達(dá)在皮質(zhì)層的垂直方向上具有區(qū)段性,但鼠類在皮質(zhì)層為均勻分布.在KAP6.1-1座位上,肉兔(福建黑兔、九嶷山兔)的多態(tài)信息含量高于獺兔和毛兔,且只有福建黑兔表現(xiàn)為中度多態(tài),原因可能是長毛兔、獺兔均是起源于肉兔,對于毛兔和獺兔的長期選育過程可能造成B等位基因頻率的降低.本試驗所擴(kuò)增KAP6.1基因的5′端序列的基本元件(CAAT盒、增強(qiáng)子、CACCC盒、TATA盒)與綿羊KAP6.1基因的5′端序列的基本元件一致,推測可能該基因在2種動物中的表達(dá)機(jī)制相同.相對于原序列,分別在5′端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)5處插入突變和CDS區(qū)域6個堿基的缺失,這可能與所選取的家兔品種不同有關(guān).KAP6.1-1座位存在2種基因型,A基因型相對B基因型在原序列的694位點上有1個插入(G),并發(fā)生了G744C和A755G