長毛兔和球兔ifn-基因克隆及生物活性分析

長毛兔和球兔ifn-基因克隆及生物活性分析

兔子，也被稱為力克斯兔子，是一種典型的皮肉混合兔子。目前我國獺兔的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,獺兔的年飼養(yǎng)量已達(dá)2000萬只以上,我國獺兔的存欄量居世界第一。長毛兔是一個較典型的毛用兔品種,國際上統(tǒng)稱為安哥拉兔(Angolabreed)。隨著長毛兔和獺兔養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖區(qū)域的不斷擴(kuò)大,疾病發(fā)生率逐漸提高,其中以消化道疾病(以大腸桿菌和魏氏梭菌病為主)、呼吸道疾病(以巴氏桿菌和波氏桿菌病為主)、急性傳染病(如兔瘟等)及寄生蟲病(如疥癬病、球蟲病等)等為主的各類疾病在兔場頻頻發(fā)生,造成長毛兔和獺兔生長發(fā)育受阻,嚴(yán)重時引起大量死亡。目前,常見兔病的防治仍以疫苗和抗生素為主,但抗生素的長期使用不僅費(fèi)用高、效果不理想,而且容易導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)和較嚴(yán)重的毒副作用,特別是藥物在畜產(chǎn)品中的殘留,通過食物鏈會對人體健康造成潛在威脅。另外,由于病毒和細(xì)菌的不斷變異,臨床上疫苗免疫和抗生素治療失敗的病例屢見不鮮。因此,迫切需要開發(fā)新型制劑用于克服疫苗和抗生素治療的缺陷。研究表明,γ-干擾素在抗病毒、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗腫瘤和抗寄生蟲方面具有重要作用。γ-干擾素制劑已被用作新型廣譜抗病毒生物制劑和免疫增強(qiáng)劑,被廣泛應(yīng)用于家畜、家禽各類病毒病和免疫系統(tǒng)疾病的治療;γ-干擾素作為細(xì)胞因子佐劑能顯著增加疫苗的免疫效果。2003年,Yuasa等首次報道了家兔IFN-γ基因的全序列,2007年,黃道超等報道了大耳白肉兔的IFN-γ基因全序列,但德系安哥拉長毛兔和白色獺兔的IFN-γ基因全序列尚無研究報道。本研究從德系安哥拉長毛兔、白色獺兔外周血淋巴細(xì)胞中克隆得到IFN-γ基因,并通過真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá),進(jìn)一步檢測其真核表達(dá)質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性,旨在得到長毛兔和獺兔的IFN-γ基因序列,分析兔γ-干擾素的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研制和開發(fā)重組兔γ-干擾素生物制劑及疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實驗動物3月齡的德系安哥拉長毛兔和白色獺兔(體重2～3kg)各1只,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)兔場提供。1.2rt-pcr和nh5表達(dá)載體質(zhì)粒pVAX1和LipofectamineTM2000Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;EcoRⅠ和XhoⅠ、pMD18-T載體、RT-PCR試劑盒(DRR055A)購自大連寶生物工程有限公司;E.coliDH5α、兔淋巴細(xì)胞分離液購自成都博瑞克生物有限公司;HighPure高純度質(zhì)粒大提試劑盒購自TIANGEN公司;UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒(BS583)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;COS-7細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲病研究室提供。1.3酶切位根據(jù)Yuasa等報道的日本家兔IFN-γ基因序列(登錄號:AB010386),利用Primer5.0軟件設(shè)計引物:P1:5′-CCGGAATTCCTCTCTGAAG-CAATGAGTTATA-3′;P2:5′-CCGCTCGAG-GGTGAGTTGATCAGTACTTGG-3′(下劃線處分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.4細(xì)胞培養(yǎng)液的制備參照黃道超等的方法進(jìn)行德系安哥拉長毛兔和白色獺兔外周血淋巴細(xì)胞的分離。將制備得到的淋巴細(xì)胞懸液稀釋至5×106/mL,分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于第24、36和72小時吸取上清,4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占囵B(yǎng)第24、36和72小時后的淋巴細(xì)胞,依據(jù)UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒(BS583)說明書提取并純化總RNA,-70℃保存?zhèn)溆谩?.5重組質(zhì)粒的鑒定RT-PCR擴(kuò)增參照大連寶生物工程有限公司的RT-PCR試劑盒(DRR055A)說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序為:94℃5min;94℃30s,50℃30s,72℃1min,30個循環(huán),最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,按pMD18-T載體試劑盒說明書進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選陽性克隆后,小量抽提陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢驗。將擴(kuò)增結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測序。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-IFN-γ。采用DNAStar軟件將測定的核酸序列與GenBank中登錄的常見家養(yǎng)動物及人的相應(yīng)序列(見表1)進(jìn)行比較分析。所有序列使用BioEdit(Version6.0.7)軟件進(jìn)行人工輔助校對,再分別利用DNAMAN5.0及MegAlign軟件進(jìn)行同源性比較,用MEGA2.0(kumer,2001)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進(jìn)行1000次的自舉檢驗(bootstraptest)。1.6pv前質(zhì)粒的制備用EcoRⅠ和XhoⅠ分別酶切長毛兔的pMD18-T-IFN-γ和pVAX1質(zhì)粒,將酶切后的片段按《分子克隆實驗指南》的方法進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。采用菌落PCR和雙酶切法篩選出構(gòu)建正確的pVAX1-IFN-γ真核表達(dá)質(zhì)粒。按HighPure高純度質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取pVAX1-IFN-γ和pVAX1質(zhì)粒。按LipofectamineTM2000Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明將pVAX1-IFN-γ和pVAX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第24、36和72小時分別收集細(xì)胞和上清。采用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后第24、36和72小時COS-7細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)情況,擴(kuò)增條件同1.5。1.7mtt法培養(yǎng)液采用MTT法檢測IFN-γ蛋白活性,具體步驟參照廖艷等的方法。將1.6中收集的各上清加入含有長毛兔淋巴母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)板孔內(nèi),每個樣品3個重復(fù),于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)33h。每孔加入5mg/mLMTT溶液25μL,繼續(xù)培養(yǎng)3h。每孔加入50μL100g/LSDS-0.01mol/LHCl溶液,37℃恒溫培養(yǎng)箱作用2h。取出培養(yǎng)板,室溫下放置20min,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測每孔的D570nm值。2結(jié)果2.1rt-pcr法檢測總rna從ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后的德系安哥拉長毛兔和白色獺兔外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,用設(shè)計的引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到約500bp的單一目的條帶,與預(yù)期大小一致(見圖1)。2.2對ifn基因的序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建2.2.1兔ifn-基因在氨基酸序列分析所測的德系安哥拉長毛兔和白色獺兔IFN-γ基因均為504bp(GenBank登錄號分別為:EF589139和EF589141),不存在插入與缺失序列。安哥拉長毛兔和白色獺兔IFN-γ基因A、T、C、G含量分別為32.7%、26.0%、20.4%、20.8%和32.5%、26.2%、20.4%、20.8%。長毛兔和獺兔IFN-γ全長基因編碼相同的氨基酸序列,共有167個氨基酸,在氨基酸序列的23與24位之間存在潛在的信號肽切割位點(HMM預(yù)測模式),成熟的IFN-γ肽包含144個氨基酸殘基;該氨基酸序列的41位、108位和117位存在N-糖基化位點。經(jīng)ExPASy蛋白質(zhì)在線分析軟件預(yù)測,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點分別為19.5ku和9.49。序列分析發(fā)現(xiàn),不同國家學(xué)者所報道的兔IFN-γ基因(AB010386、DQ680162、EF589141、EF589139及DQ852341)長度均一致(均為504bp),序列中不存在插入與缺失;這5個兔IFN-γ基因的全長序列中僅白色獺兔在492位存在1個堿基的變異(A→T),序列間的核苷酸同源性較高(99.8%～100.0%),分歧度較小(0～0.2%)(見表2);推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為100%。比較所測定的兔IFN-γ基因序列與牛、羊等常見家養(yǎng)動物及人相應(yīng)基因的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性,結(jié)果表明:兔同人、犬、豬、牛、羊及貓IFN-γ基因間的核苷酸序列同源性較高(74.9%～77.9%),推導(dǎo)的氨基酸同源性也較高(61.1%～66.5%);同雞、鴨、鵝的同源基因間核苷酸同源性較低(53.0%～53.4%),氨基酸同源性也較低(35.4%～38.0%),見表3。2.2.2相同品種兔和不同品種兔聚類基于Kimura雙參數(shù)模型,用NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹表明,國內(nèi)外學(xué)者所測定的相同品種兔或不同品種兔均聚類在一起,且自舉值較高(100);所有哺乳類動物(人、兔、犬、貓、牛、羊及豬)聚類在一起,成為一個單獨的大分支;而鳥類(雞、鴨及鵝)又單獨聚類成為另一分支(見圖2)。2.3cvi988-各組小鼠體內(nèi)的區(qū)分經(jīng)菌落PCR和EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定構(gòu)建的長毛兔pVAX1-IFN-γ重組質(zhì)粒,均得到與預(yù)期大小一致的片段(見圖3)。提取長毛兔pVAX1-IFN-γ轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后第24、48和72小時的總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增,在3個時間段的細(xì)胞中均出現(xiàn)IFN-γ的特征條帶,而陰性對照和空載體對照未出現(xiàn)IFN-γ的特征條帶(見圖4)。表明pVAX1-IFN-γ在COS-7細(xì)胞中能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。2.4pv優(yōu)勢雞細(xì)胞增殖收集pVAX1-IFN-γ轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后第24、36和72小時的上清液,利用MTT法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清對長毛兔淋巴母細(xì)胞的增殖效果,發(fā)現(xiàn)pVAX1-IFN-γ能使兔淋巴母細(xì)胞明顯增殖,與pVAX1組及空白對照組均有顯著差異(P<0.05);pVAX1組與空白對照組間無顯著差異(P>0.05);轉(zhuǎn)染不同時間的pVAX1-IFN-γ重組質(zhì)粒組間無顯著差異(P>0.05),見表4。3不同品種兔ifn-基因序列及免疫反應(yīng)規(guī)律干擾素是最早被研究,也是研究最為深入的細(xì)胞因子之一,可分為Ⅰ型(IFN-α和IFN-β)和Ⅱ型(IFN-γ)兩類。γ-干擾素主要是由抗原、有絲分裂素等一些細(xì)胞因子活化T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞合成、分泌的對免疫系統(tǒng)中多種細(xì)胞具有調(diào)控作用的一種細(xì)胞因子,具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力等多種生物學(xué)活性。目前,IFN-γ基因已成為最受關(guān)注的目的基因之一,干擾素生物制劑的開發(fā)應(yīng)用已成為世界各國的研究熱點。國內(nèi)外學(xué)者先后報道了豬、牛、羊、馬、犬、兔、貓、雞、鵝等多種家養(yǎng)動物和大熊貓、鹿等野生動物及人的IFN-γ基因,其中兔IFN-γ基因的研究報道較為滯后,僅Yuasa等、黃道超等進(jìn)行了研究報道,但尚未見有關(guān)德系安哥拉長毛兔和白色獺兔IFN-γ基因序列的報道。本研究測定的德系安哥拉長毛兔和白色獺兔的IFN-γ基因長度均為504bp,與GenBank中的兔IFN-γ基因長度相等;在堿基組成上,白色獺兔IFN-γ基因的A、T含量與GenBank中的中國大耳白兔、日本家兔同源基因序列間有差異,而安哥拉長毛兔IFN-γ基因的A、T、C、G含量與GenBank中的兔同源基因在組成上無差異。選取的5個兔IFN-γ基因的全長序列中僅白色獺兔在492位存在1個堿基的變異(A→T),導(dǎo)致其在堿基組成上與其他兔有差別,但這種僅1個堿基的變異并不排除是由于Taq酶的錯配摻入所引起的。不同國家學(xué)者所報道的兔IFN-γ基因核苷酸和氨基酸的相似性非常高(分別為99.8%～100.0%和100%)。同時基于IFN-γ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也表明,不同國家學(xué)者所報道的兔均最先聚類在一起,且具有較高自舉值(100),具有較近的親緣關(guān)系。由此可見,不同地理來源和不同品種兔IFN-γ基因間的核苷酸序列差異極小,而氨基酸序列無差異,為開發(fā)用于不同品種兔間通用的γ-干擾素生物制劑提供了理論基礎(chǔ)。IFN-γ可增加抗原提呈細(xì)胞主要組織相溶性復(fù)合物Ⅱ(MHCⅡ)分子的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)殺傷靶細(xì)胞的能力,提高IgG2a水平,誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化,從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖,進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ具有明顯的佐劑效應(yīng),能顯著增加疫苗的免疫效果。胡慧瓊等將IFN-γ質(zhì)粒與傳染性支氣管炎(IBV)S、M、N3基因DNA疫苗聯(lián)合免疫SPF雞后,