抗褐化劑對牡丹愈傷組織的影響

抗褐化劑對牡丹愈傷組織的影響

云南牡丹是中國西南部的一種特殊植物。這是牡丹科最南期的一個牡丹科。對牡丹科植物的起源、發(fā)育和地理分布的研究具有重要的學(xué)術(shù)價值。滇牡丹擁有包括白色、純黃色、綠色、紅色、紫色等珍貴花色基因資源,因此有可能通過雜交育種技術(shù),培育具自主知識產(chǎn)權(quán)的黃色、紅色及其它色系的牡丹新品種,豐富中國牡丹品種群的花色。然而,滇牡丹傳統(tǒng)的繁殖方法效率低、育種周期長,一直是生產(chǎn)和育種發(fā)展面臨的重大問題。組培快繁是促進(jìn)滇牡丹植株再生的一個重要方式。但滇牡丹為木本植物,次生代謝旺盛,組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重,80%以上的莖尖都會產(chǎn)生褐色物質(zhì)。近年來,何松林等、張俊琦等、李萍等、吳丹、周秀梅等對牡丹組培研究均取得了不同程度的進(jìn)展,但滇牡丹的愈傷褐化問題仍是急需解決的問題之一。有人報道了在牡丹葉片和葉柄離體培養(yǎng)中的褐化控制問題和組培苗在繼代培養(yǎng)中的褐化控制情況。在種胚間接誘導(dǎo)體胚繼代培養(yǎng)過程中愈傷組織也會發(fā)生嚴(yán)重褐化,從而使體胚誘導(dǎo)難以進(jìn)行,但針對這方面的褐化控制研究尚未見報道。水解乳蛋白常用于配制植物組織培養(yǎng)基和某些細(xì)菌培養(yǎng)基,經(jīng)本實驗小組前期研究表明水解乳蛋白在滇牡丹組培中具較好的抗褐化作用,而這方面的研究也尚未見報道。本實驗以繼代培養(yǎng)中滇牡丹愈傷組織的褐化控制為目的,同時研究探討5種抗褐化劑(PVP、VC、結(jié)冷膠、AgNO3、水解乳蛋白(LH))對滇牡丹愈傷組織生長的影響,以期找到既能控制褐化,又不影響生長的方法,從而較好解決滇牡丹組培中的褐化問題,并對其它牡丹種組織培養(yǎng)的褐化控制提供一定借鑒。1材料和方法1.1材料表面實驗原始材料為滇牡丹成熟飽滿種子種胚,于2009年9月在澄江梁王山采集。1.2方法1.2.1種胚的消毒處理(1)外植體的預(yù)處理及接種方法取采集的滇牡丹種子先用洗衣粉水浸泡20min,再用流水沖洗1h后,在超凈工作臺上用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒30s,用無菌水沖洗3次,然后用0.1%的HgCl2溶液處理8min,最后用無菌水沖洗5次。切開胚乳,取出種胚,接種于培養(yǎng)基A中培養(yǎng)待用。(2)培養(yǎng)基A:MS+6-BA2.0+2.4-D1.0+VC0.1g/L+AC2.0g/L,瓊脂7.0g/L,pH=7.0。培養(yǎng)條件:暗培養(yǎng),溫度:25℃。1.2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件本實驗選用前人研究中認(rèn)為抗褐化效果好的基本培養(yǎng)基,通過選用不同抗褐化劑探討其對褐化的抑制及對滇牡丹愈傷生長量的影響,以期找到既能控制褐化又不影響愈傷生長量的方法,從而較好的解決褐化現(xiàn)象。(1)轉(zhuǎn)接方法選取質(zhì)量好的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)接,每處理接種10塊愈傷組織,重復(fù)3次。(2)抗褐化劑選用將愈傷轉(zhuǎn)接到含有不同抗褐化劑的B0培養(yǎng)基中。(A1-A3):PVP500mg/L、1000mg/L、2000mg/L;(B1-B3):VC50mg/L、100mg/L、200mg/L;(C1-C3):分別用結(jié)冷膠2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L代替瓊脂;(D1-D3):AgNO36mg/L、8mg/L、10mg/L;(E1-E3):水解乳蛋白(LH)300mg/L、500mg/L、700mg/L。B0:1/2改良WPM+NAA0.5mg/L+6-BA2.0mg/L,瓊脂7.0g/L,pH=7.0。培養(yǎng)條件:光照時間12h/d,25℃。(3)褐化測定指標(biāo)根據(jù)褐化顏色程度將愈傷組織進(jìn)行分級:褐色無或淺、中、較深、深4級,分別用0、1、2、3表示,以褐化指數(shù)量化褐化情況。褐化指數(shù)計算公式:(4)滇牡丹愈傷生長量測定方法每20d統(tǒng)計一次生長量,方法是先用電子天平稱出培養(yǎng)基的質(zhì)量,然后將愈傷組織轉(zhuǎn)接進(jìn)去,再稱出培養(yǎng)基和愈傷組織的總質(zhì)量,兩者差值為愈傷組織的質(zhì)量。培養(yǎng)20d后再稱培養(yǎng)基和愈傷組織的總質(zhì)量,愈傷轉(zhuǎn)出后再稱培養(yǎng)基質(zhì)量,兩次差值為愈傷組織質(zhì)量,最終兩個愈傷組織質(zhì)量差值為20d內(nèi)愈傷增長量。再次轉(zhuǎn)接時重復(fù)上述操作。2結(jié)果與分析2.1不同處理對褐化過程的影響在轉(zhuǎn)接后第一天即可發(fā)現(xiàn)在愈傷的傷口部位出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。其中添加PVP處理的愈傷褐化現(xiàn)象大部分?jǐn)U散至培養(yǎng)基中,致使愈傷周圍培養(yǎng)基變褐;添加結(jié)冷膠處理僅有當(dāng)愈傷褐化達(dá)4級時才擴(kuò)散至周圍培養(yǎng)基使之變褐,其他3種激素處理愈傷褐化現(xiàn)象基本不會擴(kuò)散至其周圍培養(yǎng)基。從圖1、圖2可知,各處理均出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象,但均比對照褐化程度小。且隨著培養(yǎng)時間的延長褐化程度在逐步加深,褐化主要發(fā)生在培養(yǎng)的前10d,之后培養(yǎng)褐化加深程度明顯減緩,與前人在牡丹組培苗褐化研究中的結(jié)果不同。由圖1可知,第一次繼代時在培養(yǎng)的前10d各系列的褐化指數(shù)均小于50%,之后均有不同程度的增加但程度小于前10d。PVP處理在不同的時期各濃度的抗褐化性不同,并未呈某一規(guī)律;VC處理中100mg/L的抗褐化性較好;結(jié)冷膠的處理抗褐化效果整體較好,其中添加3.5g/L結(jié)冷膠時抗褐化效果最好;AgNO3和LH的抗褐化規(guī)律較為一致,在培養(yǎng)的前10dAgNO310mg/L及LH500mg/L在各處理組中抗褐化效果好,而在后10d的培養(yǎng)中則是AgNO36mg/L及LH700mg/L在各組處理中抗褐化效果好。由圖2可知,在第二次繼代培養(yǎng)中,各處理的褐化加深速度減緩,各抗褐化劑處理的抗褐化效果差異更為明顯,其中結(jié)冷膠的抗褐化效果最好,且所試驗的三濃度的抗褐化效果變化不大;其次為LH,從整體看300、500mg/L濃度抗褐化效果相差不大,而當(dāng)濃度增加到700mg/L時抗褐化效果相對較差。2.2對愈傷生長量的影響由表1可知,PVP處理中第一次繼代中三種濃度處理之間不存在顯著差異,第二次繼代500mg/L處理生長量與其他兩種濃度處理存在顯著差異,生長量低于其他兩種濃度的;VC處理生長量隨濃度的增加而升高,僅在第一次繼代中50mg/L與200mg/L處理存在顯著差異,其余均不存在顯著差異;結(jié)冷膠、AgNO3、LH處理對愈傷生長量影響作用基本一致,各濃度間均不存在顯著差異。第一次繼代生長量較大的7個處理為:AgNO38mg/L>VC200mg/L>PVP1000mg/L>AgNO310mg/L>LH500mg/L>結(jié)冷膠3.5g/L>LH700mg/L;第二次繼代生長量較大的為7個處理為:AgNO38mg/L>AgNO310mg/L>結(jié)冷膠3.5g/L>LH700mg/L>LH500mg/L>結(jié)冷膠2.0g/L>結(jié)冷膠2.5g/L。3分析與討論3.1第二次繼代過程中抗褐化效果及應(yīng)用情況本實驗發(fā)現(xiàn)各抗褐化劑對愈傷褐化的控制處于一種動態(tài)的變化,第一次繼代完成時抗褐化效果較好的七個處理為:結(jié)冷膠3.5g/L、結(jié)冷膠2.0g/L、結(jié)冷膠2.5g/L、LH700mg/L、AgNO36mg/L、AgNO38mg/L、LH500mg/L;第二次繼代完成時抗褐化效果較好的七個處理為:結(jié)冷膠2.5g/L結(jié)冷膠2.0g/L、結(jié)冷膠3.5g/L、LH700mg/LLH500mg/L、LH300mg/L、AgNO38mg/L。結(jié)冷膠在整個繼代培養(yǎng)過程中均表現(xiàn)了較好的抗褐化性,3.5g/L的結(jié)冷膠處理最為適宜;其次為LH和AgNO3在整個繼代過程中也表現(xiàn)了一定的抗褐化性,PVP和VC抗褐化性相對較差。張俊琦等在牡丹組織培養(yǎng)中褐化的發(fā)生原因與防止方法的研究中表明PVP和結(jié)冷膠能有效的緩解褐化,VC則加劇了組培培養(yǎng)物的褐化程度,與本實驗結(jié)果有一定的出入,可能是由于材料不同而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的發(fā)生。3.2化劑對組培苗生長的影響抗褐化劑對愈傷組織生長量具明顯促進(jìn)作用的處理是添加AgNO3組,這與抗褐化劑對組培苗的生長影響一致。結(jié)冷膠和LH在第一次繼代過程中并未表現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用,但第二次繼代時則表現(xiàn)了較明顯的促進(jìn)作用;而PVP和VC愈傷生長量的影響相反,說明結(jié)冷膠和LH的累積作用在一定程度上促進(jìn)了愈傷生長量的增加。3.3抗褐化劑的應(yīng)用在組培過程中抗褐化劑的添加是組培褐化控制中最常見的方法,而最理想的抗褐化劑是其在能控制褐化的同時又不能影響愈傷的正常生長。本實驗研究結(jié)果表明結(jié)冷膠3.5g/L處理在整個繼代培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出較佳的抗褐化性且愈傷生長量相對也較高;其次為AgNO38mg/L、AgNO310mg/L、LH500mg/L處理具較好的抗褐化性同時其愈傷生長量也較高。而抗褐化劑是通過某種機(jī)制直接影響愈傷生長量還是通過影響愈傷的褐化從而間接影響生長量則需做進(jìn)一步的研究探索。LH是用乳蛋白經(jīng)胰酶消化而成,含豐富的人體必需氨基酸,有機(jī)氮對很多