微衛(wèi)星dna分子標記的研究進展

微衛(wèi)星dna分子標記的研究進展

分子標記是近20年來建立的一種新的遺傳標記技術(shù)，經(jīng)過標記、生化免疫標記和細胞遺傳標記。它在ct上顯示了遺傳物質(zhì)的遺傳變化，是動物遺傳育種領(lǐng)域的一項新興技術(shù)。目前常用的分子標記主要有:限制性核酸內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)標記(RFLP),隨機引物擴增多態(tài)(RAPD)標記,擴增片段長度多態(tài)(AFLP)標記,小衛(wèi)星DNA標記,微衛(wèi)星(SSR)標記及單核苷酸多態(tài)性(SNPs)等。1普lymorphismssp微衛(wèi)星(Microsatellite)DNA也稱為簡單序列重復(fù)(simplesequencerepeat,SSR)、簡單序列長度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP)。微衛(wèi)星序列的重復(fù)單位小,是由2～6bp的短核苷酸為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的重復(fù)序列,它廣泛分布于整個真核生物基因組的不同座位上,大約每隔5～50kb就存在一個微衛(wèi)星,由于微衛(wèi)星寡核苷酸的重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同基因型間差異很大而形成多態(tài)性,一般來說,微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列兩側(cè)都有特異性的保守序列,所以,通過設(shè)計引物對基因組DNA進行PCR擴增,電泳和反射自顯影,即可檢測到多態(tài)性,這就是微衛(wèi)星DNA分子標記,目前已成為取代RFLP的第二代分子標記。2偉興dna多態(tài)性檢測原理和方法微衛(wèi)星分子標記的原理:獲得微衛(wèi)星序列—設(shè)計引物—PCR擴增—對擴增產(chǎn)物進行分析。2.1數(shù)據(jù)庫的建立為了從微衛(wèi)星DNA中獲得有效的生物學信息,微衛(wèi)星位點的獲得是微衛(wèi)星分析的關(guān)鍵(張于光等,2001)。微衛(wèi)星位點獲得的途徑主要有兩種:一種是構(gòu)建基因組文庫法。這種方法包括DNA文庫的構(gòu)建、篩選克隆片段、測序和根據(jù)序列設(shè)計PCR引物以進行微衛(wèi)星位點的擴增(張于光等,2001)。二是通過計算機檢索法。檢索Genbank(美國基因、蛋白數(shù)據(jù)庫)、EMBL(歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫)和DDBJ(日本國家遺傳研究所基因數(shù)據(jù)庫)等DNA序列數(shù)據(jù)庫,從互聯(lián)網(wǎng)上獲得含有微衛(wèi)星的序列(徐莉等,2002)。這種方法簡單、易行,省去了構(gòu)建基因文庫、雜交、測序等繁雜的工作。2.2同一物種或其它基因型的微衛(wèi)星斷層微衛(wèi)星兩側(cè)的序列在同一物種是高度保守的,所以可以根據(jù)其保守序列設(shè)計引物,用以擴增同一物種甚至其它物種其他基因型的微衛(wèi)星片斷。引物設(shè)計的原則同一般PCR擴增引物的設(shè)計。2.3dntp用量的影響引物設(shè)計好以后,就可以進行PCR擴增,擴增時要選擇合適的條件,一般可通過改變dNTP,Mg2+,Taq酶的濃度,退火溫度和時間獲得特異性擴增產(chǎn)物,然后對結(jié)果進行比較,選出有區(qū)別性的引物。3微衛(wèi)星的遺傳ropd微衛(wèi)星分子標記是目前發(fā)展最快的分子標記之一,與其他的分子標記RFLP、AFLP、RAPD相比,微衛(wèi)星標記的優(yōu)點主要表現(xiàn)在:①具有豐富的多態(tài)性。微衛(wèi)星DNA本身重復(fù)單位數(shù)的變異是形成微衛(wèi)星位點多態(tài)性的基礎(chǔ),多態(tài)性常表現(xiàn)為復(fù)等位性(Littetal,1989)。它與蛋白質(zhì)標記相比,微衛(wèi)星多態(tài)性變異程度為80%,蛋白質(zhì)多態(tài)性為28%;微衛(wèi)星平均等位基因數(shù)為5.2,蛋白質(zhì)多態(tài)性為3.0;微衛(wèi)星平均群體雜合度為47%;蛋白質(zhì)多態(tài)性為26%(王棟等,2000)。這一特點也是RFLP和RAPD不能相比的。對于RFLP來說,它主要是由于堿基突變導(dǎo)致限制性酶切位點的丟失或獲得,所以大多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性,雜合率低于50%,所提供的信息含量低,多態(tài)信息含量僅為0.2左右。而RAPD僅表現(xiàn)出顯性遺傳,不能區(qū)分雜合子和純合子(劉榜等,1997)。②數(shù)量多且分布均勻。③保守性。大多數(shù)微衛(wèi)星所在區(qū)域在生物的基因組中是比較保守的。從?；蚪M中篩選出的用于擴增微衛(wèi)星的PCR引物有56%可用于羊,3%可用于馬(Mooreetal,1991)。Dietz等(1993)直接從羊基因組中分離得到的7個微衛(wèi)星座位中的5個定位到牛的相應(yīng)同線組中。M.j.deGortari等(1997)利用1036個牛的微衛(wèi)星引物檢測其在綿羊基因組中的擴增情況,表明大約有58%(605/1036)的引物可以在綿羊的一個位點中得到擴增,大約有69%(409/605)各擴增位點呈現(xiàn)多態(tài)性。④共顯性遺傳。微衛(wèi)星DNA呈孟德爾共顯性遺傳模式,可以區(qū)別純合顯性個體和雜和顯性個體,這為遺傳研究提供了更多的可供分析的信息。儲明星(2002)對小尾寒羊、多塞特羊、多塞特公羊×小尾寒羊母羊3個綿羊群體159只綿羊進行了遺傳檢測,證實了微衛(wèi)星DNA的共顯性遺傳特性。⑤適合于進行高度自動化分析。微衛(wèi)星區(qū)域通常長度為100～300bp,這就很容易進行PCR擴增,PCR的高度靈敏性、高度特異性及操作簡便、省時使微衛(wèi)星標記的檢測十分方便而且可靠(張吉清等,2001)。4共顯性標記的應(yīng)用微衛(wèi)星隨機分布于整個綿羊基因組中,且是一種共顯性標記,已應(yīng)用于綿羊遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保存和利用,基因標定和標記輔助選擇育種以及雜種優(yōu)勢利用等分析。4.1微衛(wèi)星標記在養(yǎng)羊業(yè)上的應(yīng)用據(jù)估計,哺乳動物基因組中微衛(wèi)星的平均拷貝數(shù)約為5萬～10萬個,Crawford(1996)報道,在綿羊每個配子上微衛(wèi)星位點的自發(fā)突變率為(1.1±0.5)×10-4。所以經(jīng)過不斷的突變,不同品種在漫長的進化過程和人為選擇下,其微衛(wèi)星核心序列重復(fù)數(shù)發(fā)生不同方向、不同程度的變異,從而形成本身特有的DNA指紋圖。BuchananF.C.等(1994)利用微衛(wèi)星標記研究了羅姆尼羊、邊區(qū)萊斯特羊、薩?？搜?、澳大利亞和新西蘭美利奴羊品種的遺傳關(guān)系,推斷出了這些品種的分化時間。Forbe等(1995)研究了8個不同微衛(wèi)星標記在家綿羊和一種野綿羊群體間的變異,得出家綿羊比野綿羊具有更大的遺傳變異性。儲明星利用與Booroola羊高繁殖力主效基因FecB緊密相連的兩個微衛(wèi)星標記OarAE101和BM1329分析了小尾寒羊等5個綿羊品種的多態(tài)分布情況。用微衛(wèi)星DNA進行個體識別和分子鑒定是一項新興的生物技術(shù),在家畜上應(yīng)用的報道不少。目前國內(nèi)有人應(yīng)用微衛(wèi)星標記對克隆動物進行驗證,陳蘇民、陳南春(2000)對克隆山羊的體細胞供體、受體、濟寧青山羊母羊、公羊和羔羊進行了微衛(wèi)星DNA分析證明克隆山羊與體細胞供體山羊的微衛(wèi)星DNA的PCR擴增電泳結(jié)構(gòu)完全一致,與受體母羊和另外3只青山羊沒有直接的血緣關(guān)系。應(yīng)用微衛(wèi)星對家畜進行系譜確證是非常適合的,比如在家畜育種中必須搞清楚畜群的親子關(guān)系,這樣才能利于根據(jù)親屬信息準確選留個體并能防止群體近交的發(fā)生。然而在某些情況下(如寄養(yǎng)、母畜返情重配等),卻不能準確判斷某一個體的親代。如今借助多個微衛(wèi)星標記位點在群體中的等位基因頻率,通過計算排除率(Exclusionprobability)便可進行親子鑒定和血緣控制。Ellegren等研究表明,組合使用5個微衛(wèi)星位點(每個位點有6個以上的等位基因)時排除率為98%,而使用10個這樣的微衛(wèi)星時排除率可高達99.99%。Luikart等(1999)用22個微衛(wèi)星標記對可什米爾羊、蒙古羊、安哥拉羊群進行了親子鑒定,試驗準確率都高于0.9999。4.2阿斯塔納的afec基因和羊毛纖維直徑基因的擴增和形成分子遺傳標記和QTL間的連鎖分析為檢測QTL提供了新的手段。目前,綿羊中已經(jīng)有少數(shù)主效基因被檢測出來和大致定位。綿羊Booroola基因是高產(chǎn)仔數(shù)主效基因,采用2代全同胞作參考群體進行的連鎖分析表明該基因與OarAE101DNA標記連鎖,兩座位間相距13cM,位于第6號染色體上。Gootwine等(1998)證明微衛(wèi)星標記BM1329的A等位基因(而不是B或C等位基因)與FecB位點的B等位基因連鎖。與綿羊繁殖力和存活力有關(guān)的Inverdale基因定位于綿羊X染色體上。該基因在雜合狀態(tài)時可提高排卵率且產(chǎn)仔數(shù)增加0.6個,而在純合狀態(tài)時母羊是不發(fā)情的或出現(xiàn)斑痕卵巢并且母羊是不育的。Gootwine等(1998)通過回交三代群體內(nèi)的雜合體互交,已鑒別出OarAE101和BM1329兩個標記純合進而FecB等位基因純合的公羊和母羊,這些公母羊在一個名為“Afec”的高繁殖力阿華西綿羊育種核心群內(nèi)。綿羊Callipyge基因是引起綿羊肌肉增大,增加羊瘦肉率和提高飼料報酬利用率的主效基因,目前也正在被作為一種模式進行研究和利用。與羊毛纖維直徑有關(guān)的Drysdale基因目前還沒有定位到染色體上。AllainDetal(1996)在INRA401綿羊品系中對毛性狀和其他性狀進行QTL檢測,用7個微衛(wèi)星標記(分別定位在綿羊2、3、4、5、12和13號染色體上)對1200只羔羊及其它們的親本對羊毛性狀的QTL進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)定位在第3號染色體上的一個標記在3個家系中對毛纖維直徑的變異系數(shù)、毛長和纖維色素沉著有顯著效應(yīng),另有定位于第4號染色體上的一個標記在2個家系中對毛纖維直徑有顯著效應(yīng),表明這兩個標記與QTL可能連鎖。HenryH.M.等(1995)利用特細的美利奴(羊毛纖維直徑為16μm)與羊毛纖維粗的魯姆尼羊(羊毛纖維直徑為40μm)的回交群體組成4個家系的參考群體,用222個微衛(wèi)星標記每隔20～30cM對毛性狀進行全基因掃描,采用單一標記最小二乘法進行分析,結(jié)果表明只有一個位點與羊毛直徑的QTL存在顯著相關(guān)。儲明星等(2001)研究了兩個微衛(wèi)星座位,找到了與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著正相關(guān)的一個OarAE101基因座的等位基因(107bp)及基因型(107bp/111bp)和兩個與產(chǎn)羔數(shù)有顯著負相關(guān)的等位基因(109bp和111bp)。杜立新(2001)找到了與產(chǎn)羔數(shù)顯著正相關(guān)的等位基因OarHH55-11和BM143-12各一個標記。Lord等(1998)通過在EGF和微衛(wèi)星標記OarAE101之間加入兩個微衛(wèi)星位點MCM53和OarJL1A以及一個基因位點著絲粒自身抗原E(CENPE),進一步將FecB精確定位在綿羊6號染色體著絲粒區(qū)的微衛(wèi)星標記OarAE101和BM1329之間一個10cM區(qū)間內(nèi)。Mulsant等(1998)對綿羊6號染色體FecB(Booroola)區(qū)域進行了區(qū)間定位,報道7個額外的標記被定位在FecB基因附近18cM的區(qū)間內(nèi),與FecB最靠近的側(cè)翼標記是牛的微衛(wèi)星BMS2508和山羊的微衛(wèi)星LSCV043,它們位于FecB基因一側(cè)約2cM處。4.3微衛(wèi)星標記的多態(tài)性構(gòu)建基因圖譜是為了了解基因組的結(jié)構(gòu),是性狀控制的基礎(chǔ)和最基本的方法。在進行基因組圖譜建立過程中,標記的基因位點一般有兩類:一類主要由編碼基因和結(jié)構(gòu)基因位點構(gòu)成,位點變異小;另一類為具有高度變異的重復(fù)序列來標記DNA上的基因(結(jié)構(gòu)基因)位置(相對關(guān)系)。微衛(wèi)星標記是微衛(wèi)星中用于作圖的最常用的分子標記,用于構(gòu)建遺傳圖譜也是微衛(wèi)星標記的一個主要用途。由于是一種共顯性標記,不但簡化了遺傳分析過程,且利于不同群體間的標記轉(zhuǎn)換。目前使用微衛(wèi)星進行畜禽基因圖譜的構(gòu)建主要側(cè)重兩個方面,物理圖譜的構(gòu)建和標記連鎖圖譜的構(gòu)建。基本思路是:以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)在基因組中每隔一定距離找一個多態(tài)的微衛(wèi)星標記,當建立起達到一定的飽和度(約每隔10～20cM一個,并覆蓋90%的基因組)要求的基因圖譜之后,可以通過連鎖分析,來進行QTL定位,以確定QTL在圖譜上的位置、QTL與標記之間的距離和QTL的表型效應(yīng)等。1992年Crawford等發(fā)表了第一張用微衛(wèi)星標記構(gòu)建的綿羊遺傳連鎖圖譜,當時所使用的微衛(wèi)星標記很少,其連鎖群只有6個,包括14個標記。Montgomery等(1993)建立了一個來自12只booroola基因雜和體公羊的2個世代的半同胞家系,以尋找與booroola基因連鎖的遺傳標記,共確定了19個連鎖群,包括52個標記,其中13個連鎖群定位在綿羊染色體上。Crawford等(1995)報道了現(xiàn)在被認為是低分辨密度的第一個包括整個綿羊核基因組2070cM的遺傳連鎖圖。圖中246個多態(tài)標記有213個是微衛(wèi)星標記,有87個微衛(wèi)星標記直接來自于綿羊。1998年Gortari等發(fā)表了綿羊的第二代遺傳連鎖圖譜,其上共有標記519個,其中504個為微衛(wèi)星,常染色體圖譜總長度為3063cM,標記間距為6.4cM。這種高密度遺傳連鎖圖譜的建成為基因定位、物理圖譜的構(gòu)建及基因的位置克隆(Positionalcloning)奠定了基礎(chǔ)。4.4各施主效應(yīng)的估計微衛(wèi)星DNA標記是家畜早期選擇和標記輔助選擇中重要的分子標記,微衛(wèi)星標記輔助選擇將會改變目前群體水平上從表型值推出基因型值的選擇過程。先用分子生物學技術(shù)測定個體的基因型,在估計個體的表型和育種值,原理是利用已經(jīng)建立起來的基因圖譜,根據(jù)微衛(wèi)星與某些重要經(jīng)濟性狀座位的連鎖不平衡,采用適當?shù)臄?shù)學統(tǒng)計、定位方法估計兩者的緊密程度,定位QTL與基因組中某一位置,并得出單個QTL產(chǎn)生的效應(yīng)值。計算機模擬表明,微衛(wèi)星標記輔助選擇相對于傳統(tǒng)的表型選擇來說,可以獲得更大的遺傳進展,尤其對于低遺傳力性狀、限性性狀和后期表達的性狀,能增大選擇強度,縮短世代間隔,提高選擇的準確性。同時有目的地導(dǎo)入有益基因,剔除不利基因,以此提高群體的生產(chǎn)性能或生活力,縮短育種年限(張吉清等,2001)。Gootwine等(1998)已利用微衛(wèi)星標記OarAE101和BM1329對FecB攜帶者(布魯拉阿華西雜種羊)進行了標記輔助選擇。在純種阿華西羊群體中鑒別出BM1329位點有3個等位基因A、B、C,其等位基因頻率分別為0.04、0.38、0.58。Booroola×Awassi回交二代和回交三代雜種母羊中,BM1329標記為A等位基因的母羊平均產(chǎn)羔數(shù)比BM1329標記為B或C等位基因的母羊要多0.6(P<0.05)。當然,標記輔助選擇并不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的選擇方法,只有兩者結(jié)合起來,才能獲得更大的進展。4.5應(yīng)用微衛(wèi)星標記進行雜交組合的研究微衛(wèi)星標記屬于共顯性標記,利用這種標記,從潛在種質(zhì)資源中系統(tǒng)鑒別出現(xiàn)有雜交組合的兩個親本表現(xiàn)雜合互補的染色體區(qū)域,借助計算機分析雜種優(yōu)勢組合與微衛(wèi)星位點雜合性之間的相關(guān)性,則有可能檢測出產(chǎn)生雜種優(yōu)勢所必需的雜合性染