白頭鶴紅細胞及白細胞的檢測

白頭鶴紅細胞及白細胞的檢測

白頭鶴是世界上現(xiàn)存的15種鶴類之一。這是國家一級重要的保護野生動物。被國際自然保護聯(lián)盟（icu）列為易危物種，并列入cetesi附件。家禽的血細胞計數(shù)方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,但是家禽血細胞計數(shù)方法是否適用于白頭鶴還不清楚,白頭鶴血細胞計數(shù)的生理參考值也未建立。各種動物的紅細胞手工計數(shù)方法均可采用稀釋法,哺乳動物白細胞計數(shù)主要采用稀酸破壞法,家禽白細胞技術(shù)主要采用直接染色法。對白頭鶴白細胞計數(shù),本研究先采用了傳統(tǒng)的稀酸破壞紅細胞法、直接染色法,但計數(shù)效果均不理想。新建立的白細胞分離法則功的完成了對白頭鶴白細胞的計數(shù)。1材料和方法1.1超低溫離子束血細胞計數(shù)板;一次性真空采血管(肝素抗凝);23K超速低溫離心機(HERMLE);LD5-2A型低速離心機;1640緩沖液;淋巴細胞分離液;肝素;胎盤藍。1.2樣本2012年6月在哈爾濱北方森林動物園用真空采血管采集了2只白頭鶴抗凝血樣本,放入冰箱內(nèi)4℃保存,備用。1.3方法1.3.1管外余血加清加生理鹽水995μL于EP管中,用移液器吸取抗凝血5μL,擦去管外余血,輕輕加至裝有生理鹽水的EP底部,再輕吸上清液清洗槍頭3次,上下顛倒混勻?；靹蚝笥靡埔簶寣⒓t細胞懸液轉(zhuǎn)入到血細胞計數(shù)板的計數(shù)池中,室溫下平放3min,待細胞下沉后于顯微鏡下計數(shù)。1.3.2紅細胞計數(shù)組由于對白頭鶴白細胞計數(shù)的方法還不是很成熟,所以先用雞血進行了預實驗。具體試驗方法如下:取5mL雞抗凝血放在10mL離心管內(nèi),向其中加入等量的1640緩沖液混勻。取50mL的離心管,將10mL的人淋巴細胞分離液注入試管底部,然后將血液和1640混合液緩慢的注入,使血液和1640混合液漂浮在人淋巴細胞分離液的上面。將含有混合液的50mL離心管放入離心機,3000r/min離心15min。離心后,紅細胞、白細胞、血清分為3層,上層為血清,中間為白細胞,最底部為紅細胞。將血清和白細胞全部吸入到另外一個50mL的離心管中,放入離心機中,3000r/min,離心10min。離心后,棄掉所有液體,保留沉淀,向其中加入10mL淋巴細胞分離液充分混合均勻。然后吸出100μL白細胞渾濁液放入1.5mLEP管中,加入900μL的1640緩沖液混合均勻。吸取200μL的白細胞和1640混合液放入到另外一個EP管內(nèi),向其中加入等量的臺盼藍,染色2min。將染色的白細胞懸液沖入血細胞計數(shù)板的計數(shù)池,室溫下平放3分鐘,待細胞下后于顯微鏡下計數(shù)。用此方法,對同一樣本進行3次重復實驗。1.3.3白細胞計數(shù)用建立的白細胞分離計數(shù)法測定白頭鶴的白細胞數(shù),具體方法同1.3.2。1.3.4分類計數(shù)2結(jié)果與分析2.1同一樣品3次重復實驗的比選對同一只雞進行3次重復實驗,測得其白細胞數(shù)分別為26×109、23×109、27×109個·L-1,經(jīng)計算,其平均值為(25.33±2.08)×109個·L-1,相對標準偏差為8.217%。本實驗先用家雞進行了預實驗,建立了一種禽類白細胞的測定方法。在預實驗中,同一樣本3次重復實驗的相對標準偏差為8.217%,說明新建立的實驗方法重復性很好。預實驗獲得的雞白細胞數(shù)量為25.33×109個·L-1,和以往文獻記載的雞的白細胞數(shù)量基本相當,進一步驗證了本實驗方法的有效性。用淋巴細胞分離液將紅細胞和白細胞分離開的方法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到禽類白細胞的相關(guān)研究中,徐先云用此方法分離了野鳥的白細胞,并對白介素-2進行了研究。本實驗借用此技術(shù),分離了雞的白細胞,在對其染色后進行了計數(shù),新建了一種禽類白細胞計數(shù)的方法。2.2理化指標檢測按照1.3中描述的實驗方法,測得2只白頭鶴的平均紅細胞數(shù)是(0.415±0.134)×1012個·L-1,白細胞數(shù)是(2.84±0.58)×109個·L-1,中性粒細胞0.986×109個·L-1,嗜堿粒細胞0.345×109個·L-1,嗜酸性粒細胞0.277×109個·L-1,淋巴細胞1.233×109個·L-1。本實驗測出的白鶴紅細胞和白細胞的數(shù)量(0.415×1012、2.84×109個·L-1),和其他鶴類相比數(shù)量偏低(見表1),需要在以后的研究中進一步積累數(shù)據(jù)進行分析其原因。在用分離法分離白頭鶴白細胞的過程中,由于離心之后紅細胞層和白細胞層相臨,在操作的過程要避免白細胞收集的不完全或者帶有少量的紅細胞的現(xiàn)象出現(xiàn),以免影響實驗的準確性。將分離獲得的白細胞用臺盼藍染色,可使白細胞在顯微鏡下的形態(tài)更加清晰,方便白細胞的計數(shù),減少實驗誤差。在對白細胞計數(shù)時,由于禽類的紅細胞不容易破裂,所以禽類白細胞計數(shù)不用稀酸破壞紅細胞法,而采用直接染色法。但在本次實驗中,一直不能將白頭鶴的白細胞染色,使得無法用直接染色法對白頭鶴進行白細胞計數(shù)。家雞白細胞計數(shù)可以用直接染色法而白頭鶴不行的原因尚不清