代謝組學(xué)的研究與應(yīng)用

代謝組學(xué)的研究與應(yīng)用

代謝組學(xué)是研究生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的類型、數(shù)量和內(nèi)外因素的學(xué)科。這是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。20世紀(jì)90年代末,Nicholson首次提出“metabonomics”概念,它的含義是“定量測定生物系統(tǒng)對病理生理刺激以及基因改變產(chǎn)生的多參數(shù)代謝的動態(tài)應(yīng)答”。隨后,Fiehn又首次提出“metabolomics”概念,將代謝組學(xué)定義為定性定量測定特定限定條件下生物樣品中的總體代謝譜。隨著這項學(xué)科研究的發(fā)展,現(xiàn)在科學(xué)家們認(rèn)為代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是對某一生物或細(xì)胞內(nèi)所有低分子質(zhì)量(MW<1000)的代謝物質(zhì)進行定性和定量分析,將在內(nèi)外因素作用下產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的動態(tài)變化與病理生理相關(guān)聯(lián)。代謝組學(xué)的研究對象是生物體內(nèi)小分子代謝物總和的代謝組,它們是基因表達(dá)和代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物。代謝組學(xué)處于生命信息傳遞的終端,它能表現(xiàn)出生物體系整體功能或狀態(tài)的最終結(jié)果,并且與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)整體。代謝組學(xué)具有代謝物種類遠(yuǎn)小于基因蛋白的種類數(shù)、代謝物易被檢測、各個生物體系研究手段與技術(shù)通用等優(yōu)點。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展完善和數(shù)據(jù)處理方法的不斷優(yōu)化創(chuàng)新,代謝組學(xué)的研究范圍涉及微生物學(xué)、植物學(xué)、食品及營養(yǎng)科學(xué)、毒理學(xué)研究、臨床疾病診斷、藥物開發(fā)等諸多研究領(lǐng)域。本文將對代謝組學(xué)研究的流程及其相關(guān)的分析技術(shù)的進展進行介紹。1代謝組研究流程代謝組學(xué)研究流程一般包括生物樣品的采集,樣品預(yù)處理,數(shù)據(jù)的采集、分析和解釋等。分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法構(gòu)成其主要研究平臺。1.1樣本的采集和處理代謝組學(xué)的研究對象通常是生物樣本,一般有生物體液(如血液、尿液、唾液和腦脊液等)、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織提取液以及糞便等。實驗設(shè)計中應(yīng)充分考慮樣品收集的種類、部位、時間、樣本群體等因素。在研究人類樣本時,還需要考慮組間性別、種族、年齡、體重、飲食習(xí)慣和地域等因素。在處理生物樣本時要避免樣本受殘留酶活性或氧化還原反應(yīng)等的影響。一般需要對所收集的樣品進行快速猝滅,如采集之后立即進行液氮冷凍、酸處理等。1.2預(yù)處理方法的選擇生物樣品預(yù)處理應(yīng)該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法,并對提取條件進行優(yōu)化,除去干擾雜質(zhì),將樣品轉(zhuǎn)化為適合測定的物質(zhì)形式,以提高儀器檢測時的靈敏度和選擇性。常用的預(yù)處理方法有固相萃取、固相微萃取、親和色譜等。代謝組學(xué)研究在提取和預(yù)處理樣品的操作過程中,應(yīng)盡可能保留和體現(xiàn)樣品中代謝物組分的完整信息。1.3代謝組學(xué)研究目前代謝組學(xué)研究中數(shù)據(jù)采集最常用的分析技術(shù)包括核磁共振(NMR)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS),并且多種分析技術(shù)聯(lián)用進行代謝組學(xué)研究已成為當(dāng)今的研究趨勢。1.4生物代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)信息處理與分析是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其一般包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、模式識別與模型評價、生物標(biāo)記物篩選與鑒定、代謝物生物功能解釋和代謝通路分析等步驟。1.4.1色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的實現(xiàn)過程原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過預(yù)處理,以保留與分類有關(guān)的信息,消除實驗過程和分析過程中多余干擾因素的影響。不同分析技術(shù)有各自不同的數(shù)據(jù)預(yù)處理方式。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的原始數(shù)據(jù)信息主要是離子的保留時間、質(zhì)核比和峰面積,這些原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過歸一化、標(biāo)度化、濾噪和色譜峰對齊等步驟。這些操作可采用XCMS、Markerlynx等軟件完成。針對NMR數(shù)據(jù)的預(yù)處理主要包括消除噪聲和譜峰化學(xué)位移漂移、分段積分、歸一化、標(biāo)度化等步驟,用于預(yù)處理NMR數(shù)據(jù)的軟件主要有MestreNova、XwinNMR、Automics和MDAS等。1.4.3結(jié)構(gòu)鑒定和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建醫(yī)藥學(xué)研究中代謝組學(xué)常常需要對疾病發(fā)病機制或藥物治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物進行研究,常用的分析方法有PCA等模式識別方法、t檢驗和方差分析等。以上多元統(tǒng)計分析和單變量統(tǒng)計分析相結(jié)合,可以提高篩選差異變量的準(zhǔn)確性和可信度。篩選出的差異變量需要經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定,代謝物數(shù)據(jù)庫提高了代謝物鑒定效率,但是目前代謝組學(xué)研究尚無功能完備的數(shù)據(jù)庫。對LC-MS分析獲得的生物標(biāo)志物的定性方法還主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品的比對來判定;NMR和GC-MS分析需要經(jīng)過各自相關(guān)的數(shù)據(jù)庫匹配,如ChenomxNMRSuite、NIST、FiehnGC-MSDatabase;現(xiàn)階段,對以上分析手段也常用一些生化數(shù)據(jù)庫或者相關(guān)的文獻(xiàn)報道進行未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。1.4.4與基因組教學(xué)信息相關(guān)的疾病資料一些生化數(shù)據(jù)庫可以用于已知代謝物的生物功能解釋,如京都基因與基因組百科全書(KEGG)、METLIN、人體代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)等。通過Metaboanalyst等軟件可以得到目標(biāo)代謝通路,闡述病理生理、藥物作用等相關(guān)機制。1.5肺炎產(chǎn)物代謝組學(xué)研究代謝組學(xué)單獨使用不能全面的反映系統(tǒng)生物學(xué)的信息,將其與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果整合在一起,才能更全面深刻地闡明生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。Maier等將代謝組學(xué)分析和定量的基因組學(xué)及蛋白組學(xué)相結(jié)合對肺炎支原體進行研究,發(fā)現(xiàn)肺炎支原體的代謝途徑是通過功能單元來調(diào)控的。盡管存在技術(shù)限制、樣品復(fù)雜性及缺乏配套的數(shù)據(jù)處理等限制,此研究是組學(xué)間的整合思想的成功應(yīng)用。Connor等對2型糖尿病進行研究時,對db/db小鼠尿液采用NMR技術(shù)進行代謝組學(xué)研究,對其肝臟、脂肪和肌肉進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。將代謝和基因表達(dá)的變化綜合分析后發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型中有24個不同的途徑被改變,其對2型糖尿病的臨床研究和臨床診斷及篩選治療藥物方面具有重要意義。2測定對象適的方法進行測定預(yù)處理后,樣品中的代謝產(chǎn)物需要通過合適的方法進行測定。主要的分析技術(shù)如NMR、色譜、MS等分離分析技術(shù)及多種分析平臺的聯(lián)用在代謝組學(xué)研究中都得到了廣泛應(yīng)用。2.1nmr的動態(tài)范圍和應(yīng)用NMR方法有如下優(yōu)點:預(yù)處理簡單;樣品用量少,無損傷性;可測出的信息量大,對所有化合物的靈敏度是一樣的。尤其是NMR的氫譜對含氫化合物都有響應(yīng),可以檢測到大多數(shù)的化合物,得到豐富的樣品信息。但是在NMR方法中由于代謝物的分子小,內(nèi)源性物質(zhì)多,許多化合物的峰相互重疊、干擾,使生物標(biāo)志物常常受到不相干物質(zhì)的干擾;測量的動態(tài)范圍窄;同時,譜線展寬造成靈敏度相對較低。高分辨率的NMR可以解決靈敏度低的缺陷,使圖譜容易解析。Rai等代謝分析采用高分辨率NMR分析正常人、急性呼吸窘迫綜合征和急性肺損傷患者的支氣管肺泡灌洗液,用PCA和PLS-DA鑒別3組肺泡灌洗液的代謝譜和肺損傷相關(guān)的生物標(biāo)記物,描述人類肺損傷的程度。碳譜及各種二維NMR技術(shù)相配合也可以提供大量的結(jié)構(gòu)信息,降低了不相干物質(zhì)造成的干擾。新的脈沖實驗技術(shù)也可以提高NMR的分辨率和靈敏度。魔角旋轉(zhuǎn)核磁技術(shù)(MAS)消除了由于偶極耦合引起的譜線展寬和化學(xué)位移的各向異性。近年來新發(fā)展的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS)NMR技術(shù),又使得樣品可以不進行預(yù)處理,直接測定。Jiménez等采用1HHR-MASNMR光譜分析了直腸癌的腫瘤組織及其相連的腸黏膜,確定了改變它們代謝的共同特征及可以用于診斷、分期腫瘤的生物標(biāo)志物,并且發(fā)現(xiàn)和腫瘤相連的腸黏膜的代謝改變狀況比腫瘤組織有更強預(yù)測能力,幫助生成新的診斷和預(yù)后的方法。NMR技術(shù)的成熟和發(fā)展拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域,廣泛應(yīng)用于藥物毒性、生理病理過程機制研究、疾病的臨床診斷。2.2色譜-色譜聯(lián)合技術(shù)與NMR相比,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有檢測分離模式多樣、變量與代謝物直接相關(guān)等優(yōu)勢,逐漸成為代謝組學(xué)研究中最主要的分析工具之一。2.2.1gc-ms檢測氣相色譜(GC)是一項成熟的分析技術(shù),GC的高效分離結(jié)合MS的結(jié)構(gòu)鑒定功能,使GC-MS具有高精密度、靈敏度及耐用性,成為代謝組學(xué)研究的重要平臺之一。它與LC-MS相比,優(yōu)勢在于可從標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫中獲得化合物結(jié)構(gòu)信息,易對代謝物進行定性。不足之處為對于不揮發(fā)性組分如生物體系中極性比較大的糖類、氨基酸等成分的分析,需要進行衍生化才能得到較多的代謝組分信息。如Zeng等采用GC-MS來檢測正常體重、超重和肥胖兒童的血漿樣本,通過分析代謝指紋圖譜發(fā)現(xiàn)這3組樣本的代謝模式是不同的,經(jīng)過更進一步的非相關(guān)線性判別分析和典型相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)了與肥胖相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。在微生物代謝組學(xué)研究中,Kondo等使用GC-TOF/MS并結(jié)合PCA和OPLS-DA的方法對檢測到的酵母菌代謝物進行分析,從而來區(qū)分酵母菌在不同生長階段的代謝變化。在分析有干擾的復(fù)雜樣品時,全二維氣相色譜峰容量高、專一性強、分離效果好,其高靈敏度和聚焦效果能顯著增加代謝物的檢出量。全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOF/MS)在代謝組學(xué)中應(yīng)用前景廣闊,適合于復(fù)雜樣品的分離分析。Hantao等運用GC×GC-TOF/MS對先天性新陳代謝異?；颊吣蛞褐械挠袡C酸進行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些特定的有機酸(如巴豆酰甘氨酸等)可以作為這種疾病診斷的標(biāo)志物,并且證明了GC×GC-TOF/MS用來定量分析的有效性。Li等采用GC×GC-TOF/MS并結(jié)合模式識別方法分析了糖尿病患者和健康人的血漿樣本,最終鑒定了葡萄糖、2-羥基異丁酸、亞油酸、棕櫚酸和磷酸5個潛在的生物標(biāo)志物,表明了GC×GC-TOF/MS技術(shù)在代謝組學(xué)研究中的實用性和優(yōu)越性。2.2.2代謝組學(xué)研究可采用lc-ms和pca方法進行分析高效液相色譜(HPLC)對待測組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性沒有要求,不需繁瑣的衍生化步驟,樣品前處理簡單,檢測溫度低,分離物質(zhì)快速、高效,與MS高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點結(jié)合,具有提純和制備單一物質(zhì)的能力,是目前代謝組學(xué)研究中最常用的分析技術(shù)。HPLC有正相(NP)、反相(RP)、親水性相互作用(HILIC)和離子交換(IEC)等多種色譜分離模式。根據(jù)化合物的不同極性,選擇相應(yīng)的HPLC操作模式,可以提高對樣品的靈敏度和選擇性。如廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中的HILIC適用于分析復(fù)雜樣品中的極性物質(zhì)。Gika等利用UPLC-MS和HILIC-MS技術(shù)對26例脂肪肝患者的肝組織進行代謝組學(xué)分析,利用多元統(tǒng)計分析對數(shù)據(jù)進行分析,發(fā)現(xiàn)了和脂肪肝相關(guān)的生物標(biāo)志物,反映了脂肪肝患者肝組織的綜合代謝輪廓以及導(dǎo)致肝損傷的代謝改變。LC-MS技術(shù)主要應(yīng)用于臨床疾病診斷,部分疾病的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)等研究,它具有高通量篩選功能,通過對代謝物結(jié)構(gòu)的鑒定,可以對樣本進行針對性和細(xì)致的分析。LC-MS雖然缺少可以參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫,但可以通過它獲得代謝物精確的分子質(zhì)量數(shù),在通過數(shù)據(jù)庫進行檢測確定分子的結(jié)構(gòu)信息。LC-MS分析的缺點是共流出峰間的離子抑制/誘導(dǎo)作用、基質(zhì)效應(yīng)等問題。隨著液相和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,UPLC-MS技術(shù),LC-MS/MS等技術(shù)也被應(yīng)用到代謝組學(xué)研究上。(1)UPLC-MS技術(shù):超高效液相色譜(UPLC)是一種新型LC技術(shù),具有高通量、高分離能力、高靈敏度和專屬性等優(yōu)勢,和質(zhì)譜聯(lián)用時基質(zhì)干擾減少,改善極端復(fù)雜的樣品的分離狀況。已經(jīng)在代謝組學(xué)的各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Gika等使用UPLC-TOF/MS的方法分別分析酒精處理的大鼠和小鼠與對照動物的血漿和尿液樣本,研究酒精中毒導(dǎo)致的顯著肝損傷水平,采用主成分分析的方法找到了相關(guān)的差異代謝物。Lu等基于UPLC/MS的方法和使用PCA進行比較來研究骨碎補對“腎陽虛證”大鼠隨時間變化的恢復(fù)效果,并且鑒定了一些有顯著性差異的代謝物,這有助于進一步了解“腎陽虛證”和骨碎補對其的治療機制。(2)LC-MS/MS技術(shù):經(jīng)分離檢測的代謝物需要進一步定性定量,LC-MS/MS分析可以滿足一般定量的分析精度要求,具有良好的重現(xiàn)性和線性范圍。高選擇性、高靈敏度的MS/MS可以通過MS1及MS2對目標(biāo)化合物進行中性碎片掃描,發(fā)現(xiàn)并突出目標(biāo)化合物,顯著提高信噪比。這些特性使LC-MS/MS在代謝組學(xué)研究中獲得了廣泛使用。Gonzalez等基于UPLC-TOFMS/MS研究大鼠血清樣本,鑒定了與肝功能損害相關(guān)的生物標(biāo)志物,定量分析了肝損傷程度,與組織病理分析結(jié)果一致。Fernandez等基于固相萃取液相色譜-多級質(zhì)譜(SPELC-MS/MS)分析冠心病患者血清中的類花生酸類物質(zhì),該方法具有高度選擇性和高靈敏度,取得顯著成效。2.2.3ce-ms檢測CE-MS將毛細(xì)管電泳(CE)的快速、高效、分辨率高、高溶解性、重復(fù)性好等優(yōu)點和MS分析的靈敏度高、速度快等優(yōu)點相結(jié)合。在一次分析中可同時得到遷移時間、分子量和碎片特征信息。在生物樣品研究中,微生物等生物體的代謝物很多是極性物質(zhì),CE-MS常用于分析其中的離子性化合物。CE-MS的接口技術(shù)是影響整個檢測的關(guān)鍵因素之一,隨著接口技術(shù)的發(fā)展,CE-MS成為化學(xué)藥物研究、臨床診斷以及法醫(yī)學(xué)等的有力工具。Naz等利用毛細(xì)管電泳-飛行時間質(zhì)譜(CE-TOF/MS)分析經(jīng)超濾法預(yù)處理的大鼠血清樣本,發(fā)現(xiàn)并證實了一些代謝標(biāo)志物,這種識別生物標(biāo)記物的方法可能會用于臨床重癥指標(biāo)的監(jiān)測。Leon等用CE-TOF/MS結(jié)合傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)對6個不同品種的玉米進行了代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因玉米與野生玉米間特定代謝產(chǎn)物的差異。2.3方法上的合作目前,每種分析平臺都存在自身的局限性,諸如定性過程復(fù)雜,難實現(xiàn)全部代謝物的定量分析以及準(zhǔn)確性不足等許多關(guān)鍵問題仍然有待解決。將多種分析技術(shù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行整合,既可提供更全面的代謝物輪廓信息,使結(jié)果更完善,也使不同分析技術(shù)的結(jié)果得到互相驗證,達(dá)到分析平臺優(yōu)勢互補。在這方面,當(dāng)今許多研究者做出了不同的嘗試和探索。Ibanez等采用CE,RP/UPLC與TOF/MS結(jié)合等多平臺分析技術(shù)研究膳食多酚對人類結(jié)腸癌細(xì)胞的的抗增殖作用,發(fā)現(xiàn)多酚類代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)顯著差異,為代謝組學(xué)研究提供重要信息,這些結(jié)果可能為將來對此病預(yù)防或治療提供參考依據(jù)。Jung等采用NMR和UPLC-MS相結(jié)合的分析方法分別測定了2種不同處理方式的黃芪根樣本,結(jié)果顯示去皮根的某些主要代謝物顯著損失,表明該技術(shù)在對中藥材采收后處理中評估分析有效成分提供有力的工具。Naz等采用多平臺分析技術(shù)對大鼠血清樣本進行了代謝組學(xué)的研究,找到了相關(guān)標(biāo)志物。應(yīng)用多個分析技術(shù)互補的代謝組學(xué)研究思路,還成功地應(yīng)用于大鼠肺癌樣本的分析,取得了顯著的成效。3生物代謝研究隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展以及數(shù)據(jù)處理軟件的不斷完善,代謝組學(xué)的發(fā)展