肝郁、脾虛和肝郁脾虛模型大鼠甲狀腺功能的變化及疏肝健脾方的效用

肝郁、脾虛和肝郁脾虛模型大鼠甲狀腺功能的變化及疏肝健脾方的效用

根據(jù)之前的研究，采用強制干預(yù)、營養(yǎng)不良和游泳疲勞的綜合方法，重新創(chuàng)造了肝郁綜合征、脾虛綜合征、肝郁脾虛綜合征1-3。本研究從“異證同方”的角度,在探查同步控制下相關(guān)病因法復(fù)制出的肝郁、脾虛及肝郁脾虛證大鼠模型下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能變化的基礎(chǔ)上,比較觀察柴疏四君子湯對三個證候模型的甲狀腺軸功能的影響,以探討肝郁、脾虛、肝郁脾虛三證的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵和疏肝健脾方與此三證的關(guān)聯(lián)性,為“方證相關(guān)”［4］理論提供實證依據(jù)。1s2295b型智能放免儀器1.4儀器塑料鋼化筒(鑫濤塑料制品廠)。DDL25型低溫離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),SN2695B型智能放免γ測量儀(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)。大鼠束縛筒:為有機玻璃制成的圓筒狀結(jié)構(gòu),主筒長25cm,筒口外徑7cm,內(nèi)徑5cm;前端置有一直徑小于主筒的、可以前后調(diào)節(jié)的帶有透氣孔、便于大鼠頭伸進的有機玻璃前罩,后端為可調(diào)的開關(guān)閘門,自制。2模型治療與統(tǒng)計學(xué)處理2.1造模方法實驗前全部動物進行預(yù)游泳,剔除游泳時間<10min及>20min的大鼠。肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證大鼠模型分別采用慢性束縛法［1］、過度疲勞+飲食失節(jié)法［2］、慢性束縛+過度疲勞+飲食失節(jié)法造模［3］,連續(xù)造模28d。2.2分組處理大鼠隨機分為正常對照組、肝郁組、脾虛組、肝郁脾虛組、肝郁治療組、脾虛治療組、肝郁脾虛治療組7組,每組10只。后6組大鼠分別按上法復(fù)制肝郁、脾虛、肝郁脾虛證模型,正常對照組不予處理。其中3個模型治療組大鼠分別于造模第2周末(即造模第15天起),按3.57g·kg－1給予柴疏四君子湯顆粒灌胃,連續(xù)2周;3個模型組和正常對照組均給予等量蒸餾水。實驗第28天PM8:00開始,各組動物禁食;翌日AM8:00斷頭取血4mL,室溫放置,2500r·min－115min,取血清,-20℃保存,待測T3,T4,TSH。冰盤上迅速分離下丘腦,稱重后置于煮沸的生理鹽水(1mL)中3min,加1mol·L－1的冰醋酸0.5mL,于勻漿器中勻漿,再用1mol·L－1NaOH0.5mL中和,低溫條件下,3000r·min－130min,取上清液,于-20℃保存,待測TRH。2.4統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均為計量資料,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包,統(tǒng)計處理以ue0af±s表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,使用單因素方差分析;多組間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。3組大鼠tsh、t4的比較3.1肝郁、脾虛、肝郁脾虛三證模型大鼠血清T3,T4,TSH的變化及柴疏四君湯的作用與正常組相比,肝郁組、脾虛組和肝郁脾虛組大鼠T3,T4見顯著降低(P<0.05),TSH見顯著升高(P<0.05)。與肝郁組相比,肝郁治療組大鼠T4見顯著升高(P<0.05),TSH見顯著降低(P<0.05),T3差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與脾虛組相比,脾虛治療組大鼠T3見顯著升高(P<0.05),TSH見顯著降低(P<0.05),T4差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與肝郁脾虛組相比,肝郁脾虛治療組大鼠T3見顯著升高(P<0.05),TSH見顯著降低(P<0.05),T4有升高趨勢。見表1。4柴疏四君湯對肝郁、本虛證大鼠臟器功能的影響甲狀腺為機體物質(zhì)代謝及生長發(fā)育的重要內(nèi)分泌器官,甲狀腺激素的分泌受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。下丘腦產(chǎn)生促甲狀腺激素釋放激素(TRH)經(jīng)神經(jīng)細胞釋放到垂體促使垂體合成和分泌促甲狀腺激素(TSH)［6］,腺垂體分泌的TSH維持和促進甲狀腺功能,包括促進甲狀腺素(T4和T3)的釋放及合成［7］。通常情況下,血液中T3,T4濃度的升降對TSH存在負反饋調(diào)節(jié)作用,即血中游離T3,T4減少或升高可引起垂體TSH釋放和合成的升高或降低,共同構(gòu)成下丘腦-垂體-甲狀腺軸自動控制環(huán)路［8］。肝郁、脾虛、肝郁脾虛證是中醫(yī)學(xué)中具有一定聯(lián)系的3個不同證候,一方面肝郁與脾虛在病機上相互聯(lián)系(木不疏土,土虛木乘),另一方面肝郁脾虛證通常又是肝郁和脾虛的復(fù)合證。中醫(yī)認為肝主疏泄,脾主運化,與體內(nèi)物質(zhì)及能量代謝有密切關(guān)系。之前曾有研究表明,中醫(yī)肝郁可使包括甲狀腺素在內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌功能受累［9］。提示中醫(yī)肝郁、脾虛及肝郁脾虛證在內(nèi)涵上與現(xiàn)代甲狀腺功能有關(guān)。故本研究以甲狀腺軸功能為切入,通過觀察關(guān)聯(lián)病因及同步復(fù)制出的肝郁、脾虛、肝郁脾虛3證模型大鼠甲狀腺軸功能的變化,以探討此3證的現(xiàn)代內(nèi)涵及其異同。本實驗觀察到,肝郁、脾虛和肝郁脾虛3證模型大鼠血清均出現(xiàn)T3,T4降低并伴有TSH升高,表明此3證模型均存在一定的甲狀腺功能降低及腺垂體的功能代償狀態(tài)。這與之前實驗觀察到的由慢性束縛制備的肝郁證模型［10］、灌服大黃制備的脾虛證模型［11］及復(fù)合病因法制備的中醫(yī)肝郁脾虛證模型大鼠［3］均存在不同程度的甲狀腺合成、分泌等功能的降低,臨床曾觀察到中、重程度的脾虛證患者伴有血中甲狀腺激素T3,T4降低［12］的結(jié)果基本一致。本實驗還觀察到,3證模型大鼠血清TRH均降低,但脾虛證和肝郁脾虛證模型大鼠同時還伴有下丘腦TRH的降低,與之前觀察到的脾虛、肝郁脾虛證模型大鼠甲狀腺軸的損傷特點一致［2，3］,提示3證模型大鼠的下丘腦-垂體-甲狀腺軸涉及不同程度的下丘腦調(diào)節(jié)異常,其中肝郁證存在下丘腦TRH的釋放障礙,而脾虛和肝郁脾虛則同時還存在合成的抑制［13］。目前有關(guān)甲狀腺素和垂體TSH是否對下丘腦具有負反饋作用尚存在不同的認識,本實驗中的模型大鼠下丘腦變化是否因TSH的升高反饋性調(diào)節(jié)或因丘腦外的其他中樞因素所引起?尚待研究。中醫(yī)認為,肝郁、脾虛及肝郁脾虛3證在治法及治方上存在一定的聯(lián)系。本實驗中具有疏肝健脾功用的柴疏四君子湯含括了健脾方(四君子湯)和疏肝方(柴胡疏肝散)二方的全部藥味組成,故理論上認為,該方對3個證候模型均會顯示出不同程度的治療效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示,柴疏四君子湯對肝郁、脾虛和肝郁脾虛3證模型大鼠血清T3或T4及TSH的異常變化均有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用,其中該方對肝郁證大鼠血清T4有升高作用,但對T3無明顯影響;對脾虛證大鼠血清T3有升高作用,但對T4無明顯影響,對下丘腦TRH有升高作用趨勢;對肝郁脾虛證大鼠血清T4和T3均有升高作用或升高作用趨勢,對下丘腦TRH有升高作用。結(jié)果表明,柴疏四君湯對肝郁、脾虛、肝郁脾虛3個證候模型的甲狀腺功能均有一定的促進作用,但以對肝郁脾虛證的作用最優(yōu);柴疏四君湯對肝郁脾虛證模型甲狀腺軸中的下丘腦抑制還有一定的促修復(fù)作用。綜上,肝郁、脾虛及肝郁脾虛3個證候模型大鼠均存在一定程度的甲狀腺功能降低及下丘腦-垂體-甲狀腺調(diào)節(jié)功能異常,3證均涉及到下丘腦TRH調(diào)節(jié)異常,其中肝郁證涉及下丘腦TRH釋放的抑制,而脾虛證和肝郁脾虛證可能還存在TRH合成的抑制。中醫(yī)疏肝健脾方(柴疏四君湯)對肝郁、脾虛及肝郁脾虛3個證候模型大鼠的甲狀腺功能狀態(tài)均有一定的改善作用,但以對肝郁脾虛證的作用最優(yōu)。本研究為認識中醫(yī)證的內(nèi)涵及方證相關(guān)經(jīng)驗的合理性提供了一定實驗證據(jù)。1.1動物健康Wistar大鼠,雄性,體重(210±10)g,級別SPF/VAF,動物許可證號為SCXK(京)2009-0001,由北京維通利華實驗動物中心提供。1.2藥物藥材:人參、白術(shù)、茯苓、柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草由北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司提供,并鑒定為正品(藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張媛教授鑒定均為正品)。柴疏四君湯(柴胡疏肝散合四君子湯)用量為:柴胡4g,陳皮4g,川芎3g,香附3g,枳殼3g,芍藥3g,人參4g,白術(shù)3g,茯苓3g,炙甘草2g。上方按水提醇沉法制成顆粒,灌胃濃度配制為128.7g·L-1。1.3試劑三碘甲腺原氨酸T3(批號20120515)、甲狀腺素T4(批號20120515)、促甲狀腺激素釋放激素TRH(批號20120515)、促甲狀腺激素TSH(批號20120512)放射免疫分析試劑盒,由北京華英生物技術(shù)研究所提供。2.3指標測定血清T3,T4,TSH,TRH和下丘腦TRH:采用放免法測定,按試劑盒說明書操作。3.2肝郁、脾虛、肝郁脾虛三證模型大鼠下丘腦和血清TRH的變化及柴疏四君湯的作用與正常組相比,肝郁組、脾虛組、肝郁脾虛組大鼠血清TRH均見顯著降低(P<0.05),脾虛組、肝郁脾虛組大鼠下丘腦TRH見顯著降低(P<0.05),肝郁組大鼠下丘腦TRH差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與肝郁組相比,肝郁治療組大鼠血清和下丘腦TRH差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與脾虛組相比,脾虛治療組大鼠下丘腦TRH有升高趨勢,血清TRH差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與肝郁脾虛組相比,肝郁脾虛治療組大鼠下丘腦TRH顯著升高(P<0.05),血清TRH差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。3.3肝