桑葉總黃酮對(duì)高脂誘導(dǎo)大鼠高脂血癥、高脂血癥的早期防治作用

桑葉總黃酮對(duì)高脂誘導(dǎo)大鼠高脂血癥、高脂血癥的早期防治作用

黑莓是黑莓科植物的干燥葉子。它又冷又甜又苦。具有散風(fēng)、潤(rùn)肺、潤(rùn)肝、明肝的功效。這是中藥之一?，F(xiàn)代藥理研究證明桑葉具有降血糖、降血脂、降血壓、抗菌和抗病毒等多種藥理活性,其藥理活性與防治高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥等慢性病及延年益壽密切相關(guān),桑葉的藥理活性成分多樣,如有黃酮、生物堿、多糖、氨基酸、維生素和微量元素等,其中黃酮類成分是桑葉的主要成分,筆者前期從桑葉提取物中分離得到含量達(dá)54.2%的桑葉總黃酮(totalflavonoidsofmulberryleaf,FML),為進(jìn)一步開發(fā)利用這一植物資源,本實(shí)驗(yàn)研究采用高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)給予桑葉總黃酮預(yù)防性給藥,當(dāng)模型組大鼠產(chǎn)生高脂血癥時(shí),再聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ),探討桑葉總黃酮早期干預(yù)對(duì)大鼠體質(zhì)量、血脂、FPG、SOD、MDA、LDL-C、HDL-C(動(dòng)脈硬化指數(shù))的影響,為進(jìn)一步防治由高脂血癥引起的糖尿病及冠心病、腦卒中等高危心血管疾病有著積極的意義。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性Wistar大鼠,180~200g,湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,質(zhì)量合格證號(hào):NO.00005893,許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005。1.2脂必妥—藥品與試劑桑葉飲片,武漢九州通藥材公司,批號(hào):20081001;蘆丁對(duì)照品,中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):100080-200306;脂必妥,成都地奧制藥集團(tuán)有限公司,批號(hào):0904018;高脂飼料:含5%蛋黃粉、10%豬油、2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、20%白糖、62.8%基礎(chǔ)飼料,湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、SOD、MDA、FPG測(cè)定試劑盒,均由南京建成生物工程公司生產(chǎn)。1.3儀器、設(shè)備和水浴鍋T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī),軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠。2模型的建立及給藥2.1桑葉總黃酮的制備桑葉飲片購自武漢九州通藥材公司;用15倍量(V/m)75%乙醇回流提取3次,每次2h,提取液濃縮,所得濃縮液靜置過夜,取上層溶液上SP825大孔吸附樹脂柱,先用去離子水洗脫去除水溶性雜質(zhì),再用10%、60%、95%乙醇梯度洗脫,取60%乙醇洗脫液濃縮,再用正丁醇萃取,正丁醇萃取部分經(jīng)聚酰胺樹脂柱精制得桑葉總黃酮,以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,紫外光譜掃描確定桑葉總黃酮在420nm處有最大吸收峰,經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定純度不低于50%。2.2動(dòng)物模型的分組及給藥取雄性Wistar大鼠60只,以基礎(chǔ)飼料預(yù)飼7d,稱體質(zhì)量后將大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,Ⅰ組為正常對(duì)照組,Ⅱ組為高脂模型組,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為桑葉總黃酮低、中、高劑量組(50、100、200mg/kg),Ⅵ組為脂必妥陽性對(duì)照組(1.5g/kg)。Ⅰ組給予基礎(chǔ)飼料,其它5組給予高脂飼料。每天下午Ⅰ、Ⅱ組灌胃蒸餾水2mL,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組按劑量灌胃桑葉總黃酮2mL,Ⅵ組按劑量灌胃脂必妥2mL。每周稱1次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量。連續(xù)給藥4w后禁食不禁水12h,斷尾取血,測(cè)量血脂指標(biāo),模型組達(dá)到高脂血癥后,各組動(dòng)物禁食不禁水12h,正常對(duì)照組腹腔注射0.1mol/L,pH=4.4的檸檬酸緩沖液,其余各組腹腔注射0.1mol/L,pH=4.4的檸檬酸緩沖液溶解的STZ30mg/kg,給藥體積均為5mL/kg,腹腔注射STZ后再繼續(xù)給藥1周,分別在注射STZ后3、5、7d檢測(cè)血糖變化;采血完畢后處死,迅速取出肝臟,稱量質(zhì)量,40%福爾馬林固定,石蠟包埋、切片、HE染色。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,用SPSS11.5軟件分析,組間差異用單因素方差分析,組間兩兩比較用t檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1高脂模型大鼠體質(zhì)量比較結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后,各組大鼠體質(zhì)量均有不同程度增長(zhǎng)。高脂模型組大鼠體質(zhì)量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。桑葉總黃酮高劑量組的體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于高脂模型組(P<0.01)。3.2hdl-c、hdl-c水平結(jié)果見表2。高脂飼料造模4w后可使模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、TC/HDL-C顯著升高(P<0.01),HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,桑葉總黃酮高劑量組血清TC、TG、LDL-C、TC/HDL-C水平顯著降低(P<0.05或P<0.01),HDL-C水平顯著提高(P<0.05),說明桑葉總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠有明顯的調(diào)血脂作用。3.3桑黃酮對(duì)大鼠血清中mda、sod、mda的活性檢測(cè)結(jié)果見表3。高脂飼料造模可使模型組大鼠血清SOD活性顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.05),與模型組比較,桑葉總黃酮高劑量組血清中SOD的活性顯著升高(P<0.05),MDA的含量顯著降低(P<0.05),說明桑葉總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠有明顯的抗氧化活性。3.4物血糖檢測(cè)結(jié)果見表4。模型組、桑葉總黃酮低、中、高劑量組、脂必妥組各組動(dòng)物血糖在腹腔注射STZ后均有上升趨勢(shì),與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠血糖顯著升高(P<0.01);與模型組比較,桑葉總黃酮高劑量組大鼠血糖著性降低(P<0.05或P<0.01)。3.5黃酮對(duì)大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響肉眼觀察:正常對(duì)照組大鼠肝臟無異常變化。模型組肝臟體積明顯增大,包膜緊張,邊緣圓鈍,并見局灶性黃白色變性灶,切面油膩。桑葉總黃酮高劑量組和脂必妥組大鼠肝臟體積較正常對(duì)照組略大,包膜緊張,邊緣薄,肝臟表面奶黃色的點(diǎn)狀物較少,觸之柔軟。顯微鏡顯示:正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列成肝索(見圖1A);模型組大鼠肝組織可見中到重度脂肪肝,以肝腺泡區(qū)為主的彌漫性肝細(xì)胞空泡變性,肝細(xì)胞排列紊亂(見圖1B)。黃酮低、中劑量組大鼠肝組織脂肪變性程度較模型組降低,仍然有彌漫性的細(xì)胞空泡變性,空泡體積變小明顯(見圖1C、D)。黃酮高劑量組和脂必妥組的肝組織結(jié)構(gòu)清晰,脂肪變以輕度為主,僅有少量散在的細(xì)胞空泡(見圖1E、F)。A.正常對(duì)照組B.模型組C.桑葉總黃酮低劑量組D.桑葉總黃酮中劑量組E.桑葉總黃酮高劑量組F.脂必妥組4對(duì)大鼠血清fpg、tc、tg、ldl-c、fpg、fpg、tbg、tbg、tbg、fpg、fpg、tbg、tba、hl-c、fpg、tba、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg高脂血癥是糖尿病及大多數(shù)心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。脂質(zhì)的異常,尤其是血清TC、TG及LDL-C升高、HDL-C降低,在心血管疾病的發(fā)病中具有重要意義。本研究采用高脂飼料造模后可使模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著升高,聯(lián)合應(yīng)用小劑量STZ后,模型組FPG顯著升高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桑葉總黃酮可顯著降低高脂誘導(dǎo)的大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C、的水平,提高HDL-C的水平,并使動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(TC/HDL)顯著降低,并呈現(xiàn)劑量依賴性,提示其對(duì)糖尿病及心血管系統(tǒng)疾病有一定預(yù)防作用,說明桑葉總黃酮可降低糖尿病及心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。血清脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可誘導(dǎo)炎癥因子及炎癥反應(yīng),本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予桑葉總黃酮能顯著降低高脂誘導(dǎo)的大鼠