宇佐美曲霉aus-amii-cf1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

宇佐美曲霉aus-amii-cf1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

中國(guó)是一個(gè)擁有大量水果的大國(guó)，每年都會(huì)生產(chǎn)大量水果的副產(chǎn)品。柑橘皮富含果膠、纖維素、可溶性糖及多種礦物質(zhì)元素，是一種良好的微生物生長(zhǎng)基質(zhì)。目前，對(duì)柑橘皮的研究主要集中在內(nèi)含成分的提取，對(duì)利用微生物發(fā)酵柑橘皮生產(chǎn)酶制劑的報(bào)道較少。吳厚玖等（1997）開(kāi)展了柑橘皮渣發(fā)酵飼料中間試驗(yàn)研究，Ismail（1996）對(duì)微生物液體發(fā)酵柑橘皮產(chǎn)酶進(jìn)行研究。用柑橘皮為原料，固體發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶制劑的方法在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。我們的試驗(yàn)旨在研究酶系較全、產(chǎn)酶水平較高的宇佐美曲霉A.usamii-CF1利用柑橘皮進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。1材料和方法1.1固體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基菌種:實(shí)驗(yàn)室選育菌株A.usamii-CF1。斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：20%土豆汁、2%葡萄糖、1.8%瓊脂,自然pH值。固體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基）：干燥橘皮粉4g、豆粕1g、尿素0.1g、水10ml，自然pH值。試劑:DNS試劑、0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值4.8）、0.1M乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH值為3.0）、福林試劑(Folin試劑)、0.4M碳酸鈉溶液、0.4M三氯乙酸溶液、2%酪蛋白溶液（pH值為3.0）、100μg/ml酪氨酸溶液。1.2方法1.2.1發(fā)酵溫度對(duì)各種酶的影響在250ml三角瓶中，裝入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌均勻，121℃滅菌20min，冷卻后接入由斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后制成的濃度為107個(gè)/ml的孢子懸浮液1ml，置于28℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)60h，測(cè)定各種酶的酶活。1.2.2酶提取酶取一定量的發(fā)酵固體，加入10倍發(fā)酵固體量的蒸餾水，間歇攪拌1.5h，一層濾紙過(guò)濾得粗酶液，用蒸餾水稀釋后作酶測(cè)定用。1.2.3蛋白酶活力測(cè)定纖維素酶[羧甲基纖維素（CMC）酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶（FPA）]測(cè)定采用DNS法。酶活定義為：在pH值為4.8，溫度為50℃條件下，每分鐘水解各底物產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)纖維素酶活力。酸性蛋白酶活力測(cè)定采用福林酚法。酶活定義為：在pH值為3.0，溫度為40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。木聚糖酶的活性測(cè)定采用李彩霞（2001）介紹的方法。酶活定義為：在pH值為4.8，溫度為50℃的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量定義為1個(gè)木聚糖酶活力單位（U）。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基含水量對(duì)不同酶活性的影響用不同水分含量的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的酶活（結(jié)果見(jiàn)圖1）。從圖1可以看出：培養(yǎng)基含水量對(duì)各種酶組分產(chǎn)酶量具有顯著性影響，CMC酶在水分含量60%時(shí)產(chǎn)酶活性最高；而FPA酶酶活和β-葡萄糖苷酶在水分含量在55%時(shí)產(chǎn)酶活性最高；木聚糖酶在水分含量60%～70%時(shí)產(chǎn)酶活性較穩(wěn)定；酸性蛋白酶在水分含量50%～55%時(shí)產(chǎn)酶活性最高。本文綜合考慮各種復(fù)合酶酶活，取培養(yǎng)基含水量為55%～60%為最佳。2.2起始ph值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響用不同起始pH值的培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH值低于5時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶有一定影響，而在高于5較廣的pH值范圍內(nèi)（pH值5.0～9.0）對(duì)菌株產(chǎn)酶影響不大。經(jīng)測(cè)定，基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基提取液的自然pH值是5.40，因此，本研究以自然pH值為最終的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)pH值。2.3麩皮添加量對(duì)木聚糖酶活的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1g不同種類(lèi)的碳源進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)（見(jiàn)圖3）。由圖3結(jié)果顯示，添加麩皮有利于纖維素酶酶活和酸性蛋白酶酶活的提高，但所有的輔助碳源的添加都不利于木聚糖酶酶活的提高。經(jīng)綜合考慮，確定添加少量的麩皮作為培養(yǎng)基的輔助碳源。2.4氮源對(duì)葡萄糖苷酶產(chǎn)酶率的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.05g不同氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)（見(jiàn)圖4）。由圖4結(jié)果顯示，氮源的添加對(duì)復(fù)合酶的生產(chǎn)具有顯著影響。添加各種氮源都能明顯提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)酶率，其中（NH4)2SO4、NH4NO3、CO(NH)2和Mg(NO3)2能提高一倍以上。NH4NO3和CO(NH)2能較大幅度的提高FPA產(chǎn)量（分別比對(duì)照提高了29%和50%）。各種氮源對(duì)CMC酶活的提高效果都不大，所添加的氮源除了（NH4)2SO4外對(duì)木聚糖酶都有一定的抑制作用。不同氮源對(duì)酸性蛋白酶的影響較大，其中CO(NH)2對(duì)酸性蛋白酶的產(chǎn)生具有較大的促進(jìn)作用（產(chǎn)酶率提高31.2%）。2.5柑橘皮提取物的酶活將柑橘皮粉與豆粕配制成不同的比例進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)（見(jiàn)圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不添加豆粕的時(shí)候，幾乎不產(chǎn)酸性蛋白酶。當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為8:2時(shí)，CMC酶、濾紙酶和木聚糖酶分別已經(jīng)達(dá)到了酶活最高值；當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為7:3時(shí)，酸性蛋白酶達(dá)到了酶活最高值；當(dāng)柑橘皮粉與豆粕的比例為6:4時(shí)，β-葡萄糖苷酶達(dá)到最高值。綜合考慮，認(rèn)為柑橘皮粉與豆粕比例為7:3較合適。2.6酸性蛋白酶酶活在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加0.1g的各種無(wú)機(jī)鹽。結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，CaCl2對(duì)纖維素酶有提高作用，但對(duì)木聚糖酶有抑制作用；KH2PO4、K2HPO4能提高酸性蛋白酶酶活，但是對(duì)羧甲基纖維素酶和木聚糖酶有一定的抑制作用；Na2HPO4和NaH2PO4能使木聚糖酶酶活提高，且具有顯著性差異，但是Na2HPO4對(duì)酸性蛋白酶有一定的抑制作用。MnSO4的添加能提高各類(lèi)酶活，但不具有顯著性差異，綜合考慮各類(lèi)無(wú)機(jī)鹽對(duì)復(fù)合酶的影響，確定在培養(yǎng)基中添加MnSO4和Na2HPO4各0.1g。2.7最佳條件穩(wěn)定性試驗(yàn)用柑橘皮粉53%、豆粕23%、麩皮19%、尿素1%、Na2HPO42%、MnSO42%以及水分含量為55%～60%的培養(yǎng)基進(jìn)行淺盤(pán)擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)干燥將所得發(fā)酵產(chǎn)物制成酶制劑粗制品。該粗制品為灰褐色粉末，易溶于水。各酶組分的活力分別為：CMC酶41.6U/g、β-葡萄糖苷酶102.2U/g、木聚糖酶2079.6Ug、酸性蛋白酶7884