固相萃取-超高效液相色譜電噴霧離心串聯(lián)質譜法同時測定飲料中13種禁限用食品添加劑

固相萃取-超高效液相色譜電噴霧離心串聯(lián)質譜法同時測定飲料中13種禁限用食品添加劑

食品添加劑廣泛應用于現(xiàn)代食品行業(yè)。為了確保消費者的安全，確保添加劑的有效性和適量添加，中國嚴格限制了甜味劑、洗滌劑和棕櫚油等藥物。現(xiàn)有的檢測方法報道有:光譜法、氣相色譜法、離子色譜法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法等。光譜法由于其抗基質能力差,檢測限受到了一定的影響;氣相色譜法針對一些不可揮發(fā)的物質需要繁復的前處理過程或者衍生過程,不利于快速分析;而離子色譜在分離和檢測方面還有一定限制,應用范圍稍窄;液相色譜則由于紫外檢測的通用性,有時會由于雜質而造成目標物質的干擾,會有假陽性或者假陰性的誤判,而且常規(guī)的液相色譜在分離多組成分的時候,分析時間偏長。近年,超高效液相色譜(UPLC)的分析速度快,分離效率高的特點,以及質譜靈敏度高、專一性強等優(yōu)點被廣泛關注,逐漸成為分析微量、痕量禁限用成分的首選方法。本文建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質譜法(SPE-UPLC-MS/MS),利用SPE柱凈化樣品,富集目標物質,UPLC梯度快速洗脫分離,電噴霧離子化,多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測定量,實現(xiàn)了飲料中13種食品添加劑的同時快速檢出。1實驗部分1.1標準溶液及標準品ACQUITY-ZEVOTQ超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質譜儀(美國,Waters公司);Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國,Millipore公司);AE200分析天平(瑞士METTLER公司);SK5200型超聲波振蕩器(上?？茖С晝x器有限公司);0.22μm有機針式過濾器(上海安譜科學儀器有限公司)。HLB固相萃取小柱(3cc,60mg),Waters固相萃取裝置(美國,Waters公司)。標準品日落黃(Sunsetyellow,純度>87%),誘惑紅(AlluraredAC,純度>80%),酸性紅18(PONCEAU4RC,純度>70%),檸檬黃(Tartrazine,純度>99.9%),酸性橙Ⅱ(AcidorangeⅡ,純度>99.9%)均購自美國Fluka公司。標準品安賽蜜(Acesulfamepotassium,純度>99.9%),糖精鈉(Saccharinsodium,純度>99.9%),甜蜜素(Sodiumcyclamate,純度>99.9%),山梨酸(Sorbicacid,純度>99.9%),對羥基苯甲酸甲酯(Methylparaben,純度>99.9%),對羥基苯甲酸乙酯(Ethylparaben純度>99.9%),對羥基苯甲酸丙酯(Propylparaben,純度>99.9%),對羥基苯甲酸丁酯(Butylparaben,純度>99.9%)均購自美國SUPELCO公司。準確稱取(精確到0.1mg)適量固體標準品于50mL容量瓶中,用甲醇定容,分別配成1000mg/L的標準儲備液,儲存于4℃冰箱內,備用;吸取適量的標準儲備液,用水定容分別配制所需濃度的混合標準溶液,如需要,用水繼續(xù)稀釋成所需要的系列混合標準溶液。乙酸銨(純度>98.0%)、乙酸(純度>99.8%,色譜純)均購自CNW公司,甲醇(色譜純)購自美國TEDIA公司,氨水(分析級)購自重慶川東化工廠。實驗用水均為去離子水,均取自Millipore純水儀。1.2儀器分析條件1.2.1柱溫、進樣量、流動相及洗脫程序ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(50×2.1mm,1.7μm,);流速:0.2mL/min;柱溫:35℃,進樣量:10μL;流動相:A為10mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%乙酸),B為甲醇;梯度洗脫程序為:0.0~2.0min,5%B;2.0~6.0min,5%B遞增至30%B;6.0~12.0min30%B遞增至90%B;12.0~13.0min,90%B,13.5min還原為初始狀態(tài)5%B。1.2.2脫溶劑氣體流量離子源:ESI;離子源溫度:150℃;采用脫溶劑氣體(高純氮,>99.999%)流量:1000L/h;脫溶劑溫度:500℃;錐孔反吹氣:50L/h;碰撞氣:高純氬Ar。1.3清液制備飲料碳酸飲料:將飲料樣品倒入燒杯中,室溫下超聲15min以除去溶液中的氣體,備用;果汁等有沉淀物的飲料:將適量飲料樣品倒入離心管中,以10000r/min的轉速離心5min,抽取上層清液備用。準確稱取處理好的飲料樣品1g(精確至0.1mg)至10mL刻度管中,加入適量的水,超聲充分混勻后,定容備用。固相萃取凈化:固相萃取小柱預先利用3mL甲醇和3mL水進行活化和平衡,然后準確取上述步驟處理過的樣品清液2mL,以1.0mL/min的流速通過萃取柱進行萃取凈化,之后用0.1%乙酸水溶液清洗萃取柱,棄去清洗液,之后利用100%甲醇(含1%氨水)2mL進行洗脫,收集洗脫液,之后用水定容至10mL,利用0.22μm有機針式過濾器過濾,以備進樣。2結果與討論2.1質譜條件優(yōu)化首先采用Infusion的模式對13種目標物質連續(xù)直接進樣,根據(jù)分析物質的化學性質,在正負兩種電離模式下優(yōu)化目標物質的母離子和特征子離子以及相應的質譜參數(shù),通過質譜條件優(yōu)化,各個分析物質優(yōu)化后的質譜分析參數(shù),結合色譜條件,其保留時間、掃描模式、電離模式,質譜優(yōu)化參數(shù)見表1。(續(xù)表1)2.2酸處理劑的用量本實驗研究了水-甲醇和水-乙腈體系。體系中添加了乙酸銨不僅能夠提高分離物質在色譜柱上的保留,而且能夠提高目標物質的電離化程度,增加信號響應;而酸的加入作為分離的調節(jié)劑,抑制極性物質電離,保證分析物質以分子狀態(tài)在色譜柱上更好的保留,且對于正離子化模式的物質有促進電離的作用。綜合比較了10mmol/L乙酸銨(含0.1%乙酸)-乙腈體系和10mmol/L乙酸銨(含0.1%乙酸)-甲醇體系,考慮分離效果以及檢測物質信號強度等因素,最終選擇10mmol/L乙酸銨(含0.1%乙酸)-甲醇作為流動相進行梯度洗脫,13種目標物質峰形對稱,響應強度高。2.3洗脫溶劑的選擇HLB固相萃取柱吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,其保留機理為反相,通過一個“特殊的極性捕獲基團”來增加對極性物質的保留,因此很適合本研究工作。對于有氣體干擾的碳酸飲料首先對其進行超聲以排除溶液中氣體,對于部分有果肉或其他固體沉淀物的飲料,則首先對其進行離心處理。固相萃取實驗中,影響最大的就是洗脫溶劑的選擇。分別考察了100%甲醇(含1%氨水)、90%甲醇(含1%氨水)、70%甲醇(含1%氨水)、50%甲醇(含1%氨水),可以發(fā)現(xiàn)氨水的添加可以極大的影響色素類物質的回收率,各個目標物質的回收率均在85%以上,但是隨著洗脫液中水比例的增加,酸性橙Ⅱ、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的回收率受到的波動較大,水相的增加,洗脫強度的降低也導致目標物質回收率的相應降低,50%甲醇(含1%氨水)洗脫液對于三種物質的回收率更是小于20%。綜合考慮各個物質的回收率情況,本實驗選擇100%甲醇(含1%氨水)作為前處理萃取的洗脫條件。2.4線性回歸的測定在優(yōu)化的條件下,分別對所配制的2~500μg/L系列濃度的混合標準溶液進行測定,以目標物質的色譜峰面積y對其質量濃度x(μg/L)進行線性回歸。從表2中可以看出,13種目標檢測物質在相應濃度范圍內,相關線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.990,檢出限為0.20~6.79μg/L。2.5加標回收率和精密度在優(yōu)化的實驗條件下,向所要考察的飲料樣品中添加10、50和100μg/L的標準溶液,每個添加水平平行測定5次,進行加標回收率和精密度的測定,所得到的平均加標回收率結果和相對標準偏差(RSD)結果見表3。2.6樣品的測定結果分別對市售的六種不同類型的飲料(包括2種碳酸飲料,2種果汁飲料,2種茶飲料)進行檢測,有一個樣品檢出檸檬黃,含量為0.50mg/kg,有兩個樣品檢出安賽蜜,含量分別為0.70mg/kg和0.55mg/kg,有兩個樣品檢出對羥基苯甲酸甲酯,含量分別為0.75mg/kg和0.90mg/kg,對照國家標準(GB2760-2011),所檢測結果均在標準要求范圍內,符合國家規(guī)定。3流動相-色譜-質譜條件本研究建立了同時檢測飲料中13種食品添加劑(包括3種甜味