共濟失調(diào)血管瘤擴張癥am基因的2例突變分析

共濟失調(diào)血管瘤擴張癥am基因的2例突變分析

共濟失調(diào)（at）是一種罕見的共濟失調(diào)（ar）疾病，發(fā)病率約為14.1/10萬。臨床上主要表現(xiàn)為進展性腦癱共濟失調(diào)、結(jié)膜充血、面部皮膚毛細血管擴張、反復(fù)發(fā)作性呼吸道感染。同時，它對輻射有非常敏感的敏感性，染色體不穩(wěn)定，容易患腫瘤、免疫缺陷和抗輻射疾病。Savitsky和Uziel等率先克隆AT的疾病基因(ATM),并將其定位于11q22.3。目前國際上已報道了400余種ATM基因突變類型。為了解ATM基因在中國人AT患者中的突變情況,我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)結(jié)合DNA序列分析方法,對近年來收集到的2例中國人AT患者進行了ATM基因的突變研究。1對象和方法1.1年齡、年齡及性別分布2例AT患者為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及中國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室所收集,均來自湖南省,漢族人。發(fā)病年齡分別為9歲(男性)和10歲(女性),病程分別為4年和5年,臨床診斷均符合Harding標準。無家族史,父母均系近親結(jié)婚,遺傳方式符合AR。對照組為100名健康成年人,以確定所檢測到的變異是否系A(chǔ)TM基因的多態(tài)現(xiàn)象。1.2基因組dna提取抽取患者及其父母和100名無血緣關(guān)系的健康成年人外周靜脈抗凝血10ml,按標準酚/氯仿法提取基因組DNA,按GIBCOBRL公司的TRIzol試劑說明提取總RNA。1.3選擇和檢測突變因素1.3.1引用和設(shè)計PCR引物覆蓋ATM基因全編碼區(qū),是參照Telatar等設(shè)計并作一些修正,由上海博亞公司合成。1.3.2pcr擴增及條件2μgRNA中加入0.5μg引物OligodT,加入無菌水使總體積≤15μl,70℃滅活5min后置于冰上,離心后加入M-MLV5×緩沖液5μl,200μmol/LdNTP,25U酶抑制劑,200U逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLVRT,用無菌水補至25μl,42℃水浴1.5h。以cDNA為模板進行擴增,上述設(shè)計的引物為特異性引物,β-actin作內(nèi)對照。PCR總反應(yīng)體積為25μl,其中DNA模板為50ng,dNTP為200μmol/L,特異性引物各為10pmol/L,β-actin引物各為3pmol/L,MgCl2為1.5mmol/L,10×緩沖液2.5μl,TaqDNA聚合酶為0.5U。PCR反應(yīng)條件為:在PE9600熱循環(huán)儀(美國PE公司)上95℃預(yù)變性4min后95℃變性40s,65℃退火1min(每個循環(huán)降低1℃),72℃延伸3min,共15個循環(huán);95℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸3min,共25個循環(huán);最后72℃延伸10min。取4μlPCR產(chǎn)物,上樣于6%聚丙烯酰胺凝膠,電泳條件為0.5×TBE電泳緩沖液,300V恒電壓,電泳時間40min,硝酸銀染色觀察結(jié)果。1.3.3測序結(jié)果比較按常規(guī)方法回收純化PCR產(chǎn)物,經(jīng)ABI3100自動測序儀正反向測序,測序結(jié)果與人類基因組ATM基因序列比較(GenBank序列號607585),使用DNASTAR軟件分析結(jié)果。1.4根據(jù)sdna水平，突變1.4.1引用和設(shè)計根據(jù)RT-PCR及測序結(jié)果,在ATM基因gDNA序列相應(yīng)的外顯子上設(shè)計引物(表1),由上海博亞公司合成。1.4.2pcrtaqnaPCR總反應(yīng)體積為25μl,其中DNA模板為100ng,dNTP為200μmol/L,特異性引物各為10pmol/L,MgCl2為1.5mmol/L,10×緩沖液2.5μl,TaqDNA聚合酶為0.5U。PCR反應(yīng)條件為:在PE9600熱循環(huán)儀(美國PE公司)上95℃預(yù)變性4min后95℃變性50s,60℃退火30s(每個循環(huán)降低1℃),72℃延伸1min,共10個循環(huán);95℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸50s,共25個循環(huán);最后72℃延伸10min。取4μlPCR產(chǎn)物,上樣于6%聚丙烯酰胺凝膠,電泳條件為0.5×TBE電泳緩沖液,300V恒電壓,電泳時間40min,硝酸銀染色觀察結(jié)果。1.4.3測序結(jié)果比較按常規(guī)方法回收純化PCR產(chǎn)物,經(jīng)ABI3100自動測序儀正反向測序,測序結(jié)果與人類基因組ATM基因序列比較(GenBank序列號607585),使用DNASTAR軟件分析結(jié)果。2pcr擴增結(jié)果及分析對ATM基因從cDNA擴增后進行DNA序列分析發(fā)現(xiàn)異常后,再在ATM基因gDNA序列相應(yīng)的外顯子上設(shè)計引物行PCR擴增,經(jīng)DNA序列分析,共發(fā)現(xiàn)3種ATM基因突變(表2,圖1、2):患者1為純合突變,其父母均為攜帶者;患者2為復(fù)合性雜合突變,其錯義突變6679(C→T)來自母方,而無義突變610(G→T)來自父方。3at基因突變共濟失調(diào)毛細血管擴張癥1941年由Louis-Bar首次報道,故又稱Louis-Bar綜合征。它是一種臨床表型和發(fā)病機制均很復(fù)雜的遺傳病,臨床確診有時很困難,基因診斷是診斷該病的金標準,且有助于早期診斷、癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷,對開展遺傳咨詢有重要意義。ATM基因全長約150kb,cDNA12kb,共有66個外顯子,第4外顯子為第一個編碼外顯子,開放閱讀框(openreadingframe,ORF)有9168個核苷酸,編碼一個有3056個氨基酸殘基,分子質(zhì)量為350000u的蛋白質(zhì)ATM。ATM基因的突變具有極高的異質(zhì)性,突變方式和突變檢測都極為復(fù)雜。到目前為止,國外已經(jīng)報道了400余種ATM基因突變,絕大多數(shù)AT患者為復(fù)合性雜合突變,突變形式有錯義突變、無義突變、剪切位點突變、小片段插入突變、小片段缺失突變、大片段缺失和同義突變等,突變位點遍布基因全長,無突變熱點。研究表明,世界各地ATM基因的突變頻率存在明顯的種族和地理差異性,在以色列猶太人群中最常見。本研究中2例中國人AT患者的ATM基因突變分析,共發(fā)現(xiàn)3種點突變,其中2種為錯義突變,1種為無義突變?；颊?發(fā)生的錯義突變1346(G→C)為純合突變,父母均為攜帶者,編碼氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)楸彼?Ala)?；颊?為復(fù)合性雜合突變,其錯義突變6679(C→T)來自母方,編碼氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)殡装彼?Cys);其無義突變610(G→T)來自父方,編碼氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)榻K止密碼子(Term)。這是國際上尚未見報道的3個ATM基因新突變。研究表明,不同的ATM基因突變類型造成AT患者的表現(xiàn)型、疾病嚴重程度和預(yù)后存在較大差異。本研究中2例患者的基因突變類型不同,而臨床表現(xiàn)和疾病嚴重程度卻相差不大,原因不明,有待于進一步研究。國外研究報道AT患者易并發(fā)淋巴瘤、白血病、乳腺癌等惡性腫瘤,尤以雜合子風(fēng)險更高[7,8,9,10,11,12,13]。在本研究中未見發(fā)生,可能是病程還不長的原因,有待于進一步追蹤。由于本研究中樣本量較少,無法研究AT患者的表現(xiàn)型和ATM基因突變類型的相關(guān)性,下一步我們將擴大樣本收集量,將AT的基因突變研究深入開展下去。ATM基因的克隆為AT的基因診斷和癥狀前診斷奠定了基礎(chǔ),并且很大程度上解決了該病臨床診斷困難的問題,但是ATM基因突變?nèi)绾我餉T的機制尚不清楚。ATM蛋白在胎兒和成人組織內(nèi)均有廣泛表達,其功能域包括磷酯酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3kinase,PI3K)、Rad3、亮氨酸拉鏈(leucinezipper,LZ)、局部的連接區(qū)域(focaladhesiontarget,FAT)、局部的連接區(qū)域C端(FATC)等。PI3K蛋白家族成員