基于代謝組學(xué)技術(shù)的四逆散抗肝損傷的生物標(biāo)志物研究

基于代謝組學(xué)技術(shù)的四逆散抗肝損傷的生物標(biāo)志物研究

代謝組是一門定量的生物系統(tǒng)外源性代謝組規(guī)律，它通過刺激或干擾生物系統(tǒng)，如內(nèi)源性代謝組，闡明生命代謝活動(dòng)的生物學(xué)活動(dòng)性質(zhì)。代謝組學(xué)全景式、整體互動(dòng)性的特點(diǎn)與中藥復(fù)方“多途徑”、“多層次”、“多靶點(diǎn)”的整體作用理論相一致。四逆散為東漢張仲景《傷寒論》首載,由柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草四味藥物等份組成,具有解郁透熱、疏肝理脾之功效。近代藥理學(xué)研究也證明四逆散對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性肝損傷有明顯的改善作用。本室對(duì)其化學(xué)成分、內(nèi)在質(zhì)量、藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。但迄今為止,四逆散的藥理研究還僅限于臨床或?qū)嶒?yàn)藥效學(xué)研究階段,未見從代謝組學(xué)的角度在分子水平上探討其整體藥效的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)的研究策略,以UPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究大鼠血清代謝物譜的變化,從而闡述四逆散抗肝損傷可能的作用機(jī)制。動(dòng)物的基本情況藥材及樣品制備柴胡(市售)為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)的干燥根,白芍(市售)為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根,枳實(shí)(市售)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)的干燥幼果,甘草(市售)為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖。以上藥材均由沈陽藥科大學(xué)藥用植物教研室路金才教授鑒定。按四逆散原方配比稱取藥材粗粉適量,加入12倍量水,浸泡50min,回流提取3次,每次30min,合并濾液,濃縮。75%乙醇醇沉,靜置過夜,濃縮至干。提取物用0.5%CMC-Na溶液溶解,制成灌胃劑(4kg·L-1),于4℃保存?zhèn)溆?。試藥與儀器對(duì)照品:C16∶0、C18∶0、C18∶1溶血磷脂酰膽堿(美國(guó)Sigma公司);苯丙氨酸、色氨酸(天津市博迪化工有限公司)。水飛薊素膠囊(德國(guó)馬博士大藥廠);CCl4為分析純(天津康科德試劑公司);乙腈(TEDIA公司)、甲酸(Dikma公司)均為色譜純,去離子水(杭州娃哈哈純凈水公司)。ACQUITYUltraPerformanceLCTM超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),WatersQuattroMicroAPI三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配備電噴霧離子源(美國(guó)Waters公司)。動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠32只,體重220~300g,由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SCXK(遼)2010-0001。動(dòng)物分組與給藥32只大鼠隨機(jī)分為4組,分別為正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組(水飛薊素)、四逆散組。陽性對(duì)照組(30mg·kg-1)與四逆散組(10mL·kg-1)每天灌胃給藥1次,連續(xù)5天。正常對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。于末次給藥后2h,除正常對(duì)照組外,腹腔注射新鮮配制的40%CCl4大豆油溶液(3mL·kg-1),正常對(duì)照組注射等體積大豆油。樣品的采集和預(yù)處理大鼠造模24h后,腹腔注射10%水合氯醛水溶液(3mL·kg-1)麻醉,腹主動(dòng)脈取血置于不涂肝素鈉的離心管中,室溫放置2h后,4℃離心15min(13000r·min-1),取上清血清,-80℃保存待測(cè)。分析前將血清樣品于室溫下解凍,取血清200μL,加入乙腈600μL,渦流30s,離心10min(13000r·min-1),取上清700μL,40℃N2流下吹干,殘?jiān)盟?乙腈(90∶10)100μL復(fù)溶,渦旋30s,離心5min(13000r·min-1),取上清液進(jìn)樣分析。色譜和質(zhì)譜條件色譜條件:ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(2.1mm×100mm,1.7μm,美國(guó)Waters公司),流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),流速0.25mL·min-1,柱溫40℃,樣品室溫度4℃,進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫:0~0.5min,100%A;0.5~20min,0%~95%B;20~21min,95%B。質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源(ESI);正負(fù)離子同時(shí)掃描;全掃描(FullScan),掃描范圍m/z100~1000;毛細(xì)管電壓為3.0kV(ESI+),2.8kV(ESI-);錐孔電壓為35V;源溫度為120℃;脫溶劑氣為N2,脫溶劑氣溫度為350℃,脫溶劑氣體積流量為400L·h-1;錐孔氣體積流量為30L·h-1;碰撞氣為Ar。數(shù)據(jù)處理采用MarkerlynxV4.1工作站(美國(guó)Waters公司)對(duì)采集得到的譜圖進(jìn)行峰識(shí)別、匹配和歸一化等處理后,得到由保留時(shí)間-質(zhì)荷比、樣本名稱和歸一化后的離子強(qiáng)度組成的三維矩陣。導(dǎo)入到SIMCA-P11.5(Umetrics,Umea,Sweden)軟件包進(jìn)行PCA分析,產(chǎn)生得分矢量圖(scoreplot)用以獲得樣品分類信息,載荷矢量圖(loadingplot)用以發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。結(jié)果1不同濃度正負(fù)離子模式下大鼠的肝臟損傷模型分析采用UPLC-MS進(jìn)行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集,圖1為典型大鼠血清樣品正、負(fù)離子模式下的基峰離子流色譜圖(BPI)。為了考察肝損傷模型大鼠體內(nèi)代謝的變化,將正常對(duì)照組大鼠和模型組大鼠的UPLC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析,得出反映兩組大鼠組間離散程度的得分圖(圖2)和尋找相關(guān)生物標(biāo)志物的載荷圖(圖3)。由得分圖可知,在正負(fù)離子模式下兩組大鼠均可實(shí)現(xiàn)明顯分離(R2X分別為0.892和0.871),表明肝損傷模型建立成功。根據(jù)載荷圖找到了對(duì)兩組分離貢獻(xiàn)較大的代謝物,并對(duì)這些代謝物歸一化后的離子強(qiáng)度進(jìn)行t檢驗(yàn),來確定潛在的生物標(biāo)志物。2衍生物物質(zhì)及鑒定潛在標(biāo)志物的鑒定方法為通過一級(jí)質(zhì)譜信息確定相對(duì)分子量,利用二級(jí)質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。查閱HMDB、KEGG、MassBank和METLIN等在線數(shù)據(jù)庫,對(duì)比標(biāo)志物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息,完成代謝物的鑒定,并使用對(duì)照品進(jìn)行更進(jìn)一步的驗(yàn)證。以正離子模式下tR_m/z為17.8_524.5的代謝物為例說明其鑒定過程。圖4為該代謝物在正、負(fù)離子模式下的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。除代謝物的準(zhǔn)分子離子m/z524.5([M+H]+)外,還可見m/z546.5([M+Na]+)。圖4b可見m/z568.5([M+HCOO]-)和m/z508.5([M-CH3]-)。因此推測(cè)代謝物的相對(duì)分子質(zhì)量為523。圖4c可見m/z184.0和m/z103.8的離子峰,這兩個(gè)離子為磷酯酰膽堿(PC)類物質(zhì)的典型碎片離子,推測(cè)此代謝物可能屬于磷酯酰膽堿類物質(zhì)。此外,圖4c中還出現(xiàn)m/z506.3([M+H-H2O]+)的碎片離子,說明此代謝物可能含有羥基,故進(jìn)一步推測(cè)它可能屬于溶血磷酯酰膽堿類化合物。圖4d中出現(xiàn)了m/z283.3的響應(yīng)很強(qiáng)的離子,可能為溶血磷酯酰膽堿中的脂肪酸鏈,根據(jù)脂肪酸的結(jié)構(gòu)通式推測(cè)其可能為[C17H35COO]-。最后通過對(duì)照品比對(duì),鑒定此代謝物為C18∶0LPC。其他代謝物采用相同的方法進(jìn)行鑒定。對(duì)于tR15.9min(m/z319.3)的代謝物,通過一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息,參考文獻(xiàn)及查閱METLIN等在線數(shù)據(jù)庫,都未完成其鑒定。但是經(jīng)過PCA分析,發(fā)現(xiàn)此代謝物對(duì)分組的貢獻(xiàn)很大,不能忽略,本課題組正在對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定分析。結(jié)合載荷圖、t檢驗(yàn)及代謝物的鑒定,在血清UPLC-MS代謝組學(xué)研究中共找到10種發(fā)生顯著變化的標(biāo)志物(表1),鑒定出9種。結(jié)果表明,與正常組相比,模型組大鼠血清中苯丙氨酸、色氨酸、GCDCA代謝物的水平均顯著升高;溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)LPC16∶0、LPC18∶0、LPC18∶1、LPC16∶1、LPC20∶4、LPC22∶6等6種代謝物的水平均顯著降低。這些發(fā)生顯著性變化的代謝物預(yù)示著肝損傷大鼠體內(nèi)的多個(gè)代謝途徑發(fā)生了異常,涉及到體內(nèi)的氨基酸代謝、脂代謝、膽汁酸代謝以及體內(nèi)氧化-抗氧化作用平衡的改變。3逆散對(duì)大鼠體物質(zhì)的影響為考察四逆散對(duì)肝損傷模型大鼠血清代謝物譜的影響,將正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組與四散給藥組大鼠的正、負(fù)離子模式下的血清代謝物譜別采用PCA進(jìn)行模式識(shí)別,得到4組大鼠的得分(圖5)。從圖中可以看出給予四逆散、陽性藥物水薊素干預(yù)的兩組大鼠介于正常大鼠和模型大鼠之在一定程度上說明四逆散具有抗肝損傷的作用。從1中也可以看出,與模型組相比,四逆散組大鼠體潛在標(biāo)志物的水平達(dá)到顯著差異的水平,且有向常大鼠恢復(fù)的趨勢(shì),說明血清中可能與肝損傷相的生物標(biāo)志物在四逆散的作用下趨于正常,體內(nèi)關(guān)的代謝紊亂得到了調(diào)整。另外,通過t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組相比,四逆散組大鼠血清中苯丙氨酸、氨酸、GCDCA代謝物的水平均顯著升高(P<0.05);溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)LPC16∶0、LPC18∶0、LPC18∶1、LPC16∶1、LPC20∶4和LPC22∶6六種代謝物的水平均顯著降低(P<0.05),說明四逆散組大鼠標(biāo)志物的水平還沒有完全恢復(fù)到正常,這可能是由于用藥時(shí)間較短、用藥量較少造成的。但是通過以上綜合分析發(fā)現(xiàn)四逆散組標(biāo)志物的水平有向正常大鼠恢復(fù)的趨勢(shì)。4逆散對(duì)ccl4致肝損傷大鼠血清膽汁酸代謝的影響4.1氨基酸代謝本實(shí)驗(yàn)中肝損傷模型大鼠血清中苯丙氨酸和色氨酸濃度明顯升高,預(yù)示著CCl4致肝損傷模型與氨基酸代謝紊亂密切相關(guān)。苯丙氨酸與色氨酸都是人體所必需的芳香族氨基酸,在正常情況下,作為氨基酸合成機(jī)體組織細(xì)胞各種蛋白,色氨酸還參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)發(fā)生肝損傷或病變時(shí),由于肝功能出現(xiàn)障礙,肝細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝降低,同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致血中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)濃度升高,甚至?xí)哪蛑衼G失,同時(shí)本身對(duì)氨基酸的攝取能力降低。與模型組相比,四逆散組大鼠體內(nèi)苯丙氨酸和色氨酸水平顯著降低,說明四逆散可以通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝干預(yù)肝損傷。4.2膽汁酸代謝、脂代謝模型組大鼠血清中GCDCA濃度明顯高于正常組,提示CCl4致肝損傷模型大鼠體內(nèi)膽汁酸代謝受到干擾,從而引起脂代謝功能障礙。GCDCA為結(jié)合型膽汁酸,由甘氨酸和鵝脫氧膽酸結(jié)合而成,在肝損傷模型大鼠血清中,由于肝功能損傷,血液中膽紅素累積,肝細(xì)胞合成初級(jí)膽汁酸增加,再與甘氨酸結(jié)合,促進(jìn)了GCDCA的排出量,經(jīng)過肝腸循環(huán),GCDCA重吸收量增加,使得其在血液中檢測(cè)到的量也增加。因此,肝臟損傷越嚴(yán)重,其在血清中含量也越高。與模型組相比,四逆散組大鼠體內(nèi)GCDCA水平顯著降低,提示四逆散可以通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝,產(chǎn)生降脂效果,干預(yù)肝損傷。4.3氧化-抗氧化作用平衡LPC是一類炎癥因子,毫摩爾濃度的LPC就有著聚集單核細(xì)胞和促使巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí),重要的免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及樹狀細(xì)胞均會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞因子受體的表達(dá)受到抑制,細(xì)胞因子的量隨著肝損傷程度的增加而減少,進(jìn)一步引起肝臟的合成、代謝、轉(zhuǎn)化功能下降,形成了惡性循環(huán)。模型組大鼠血清中的LPC類物質(zhì)均降低,說明大鼠體內(nèi)處于嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)。研究表明,四逆散具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷、提高清除自由基酶的活性及增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化損傷的能力。與模型組相比,四逆散組大鼠體內(nèi)LPC水平均顯著升高,提示四逆散可以通過調(diào)節(jié)氧化-抗氧化作用平衡,產(chǎn)生降脂效果,從而起到抗肝損傷的作用。以上代謝途徑是相互聯(lián)系的,例如,GCDCA的前體為膽固醇,在體內(nèi)主要與脂類代謝有關(guān),對(duì)油脂消化和脂溶性維生素的吸收有重要作用。膽固醇與卵磷脂可生化反應(yīng)生成膽固醇脂和溶血磷脂。在肝細(xì)胞損傷時(shí),膽固醇脂的合成降低;由于缺氧或氧化磷酸化障礙,致使ATP和CDP-膽堿的形成不足,造成磷脂及極低密度脂蛋白(VLDL)的合成障礙,導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪向體循環(huán)的釋放不足,促使肝細(xì)胞中甘油三酯的堆積,磷脂酰膽堿顯著減少,結(jié)合型膽汁酸含量增高。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示模型組LPC含量顯著減少,GCDCA含量顯著增高,與文獻(xiàn)結(jié)果相符。脂代謝、膽汁酸代謝以及體內(nèi)氧化-抗氧化作用平衡相互聯(lián)系,相互作用。四逆散通過調(diào)節(jié)這些代謝途徑發(fā)揮藥效,充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方“多途徑”、“多層次”、“多靶點(diǎn)”的整體作用的特點(diǎn)。ccl4在生物樣品前處理方法上的應(yīng)用本文鑒定出9個(gè)與CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物,包括氨基酸類、膽汁酸類、溶血磷脂酰膽堿類,文獻(xiàn)采用快速分離液相色譜-串