雞蛋雞蛋中溶菌酶含量和活力的測定

雞蛋雞蛋中溶菌酶含量和活力的測定

溶菌酶是一種能夠通過分析細胞膜成分中的n-羥色胺和n-羥色胺-1.4糖苷鍵的酶。廣泛應用于醫(yī)藥、食品工業(yè)、生物工程等領域?，F(xiàn)在，從雞蛋和蛋黃花中提取的溶菌酶達到了工業(yè)化生產(chǎn)水平。蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越強,越有利于雞蛋的保存,因此測定雞蛋蛋清中的溶菌酶對我國溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工有重要的指導作用,也為蛋品質(zhì)評定提供了一個重要參數(shù)。對溶菌酶的研究始于20世紀初,英國細菌學家弗萊明在1922年發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚有強大的溶菌活性,并把其溶菌作用的因子命名為溶菌酶。此后研究者在人和動物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在,其中雞蛋蛋清的溶菌酶含量最高(約含0.3%)。雞蛋蛋清已成為溶菌酶生產(chǎn)的主要原料,但是蛋清中溶菌酶的定量測定還沒有一個較便捷的方法,傳統(tǒng)的方法是先提取蛋清中的溶菌酶,再測定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶,這種方法計算出的蛋清溶菌酶含量往往比實際的數(shù)值小。溶菌酶活力的測定方法很多,目前,國內(nèi)常用的有瓊脂板擴散法、比色法、高效液相色譜法等,而國外多用比濁法測定溶菌酶活力。本研究在比濁法的基礎上,針對雞蛋蛋清中溶菌酶的含量和活力設計出一套系統(tǒng)的測定方法,為蛋清中的溶菌酶測定提供一個標準方法,規(guī)范我國禽蛋中溶菌酶的測定。1材料和方法1.1溶壁微菌種m.lysodeimctus雞蛋蛋清溶菌酶(20000U/mg)購自美國Sigma公司;溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)購自中國科學院微生物研究所,菌種編號1.634;其他試劑均為分析純級。1.2有關溶解酶含量的測定1.2.1標準曲線的繪制溶菌酶用0.9%氯化鈉稀釋成不同梯度濃度(0、0.2、0.4、0.8、1mg/mL),以溶菌酶工作液濃度為橫坐標,281nm波長處吸光度為縱坐標繪制標準曲線,并求出回歸方程。1.2.1浴5天時析蛋清用0.9%氯化鈉稀釋,乙酸調(diào)溶液至pH4.5,77℃水浴10min后取出,靜置1h。離心取上清,按照標準曲線繪制的操作測得OD281值,由標準曲線回歸方程計算蛋清溶液中溶菌酶的含量(C),再乘以稀釋倍數(shù)即為蛋清中溶菌酶的含量(P)。1.3內(nèi)酶活性測定1.3.1用0.2mol/ml代替產(chǎn)生的溶壁微生物1.3.2血清中每嫌犯總a、b將蛋清溶液、菌液于25℃水浴中保溫,反應體系見表1。記下反應15s和75s時的讀數(shù)A1、A2。按每分鐘OD450值下降0.001為1個活力單位(U)的定義,蛋清中每毫克溶菌酶的活力用以下公式計算:式中,△E450為450nm波長處吸光度A1、A2之差;C為蛋清溶液中溶菌酶的含量(μg/mL)。1.4準確度、精度和開口1.5重復試驗1.6伊薩蛋和京海黃蛋中的溶菌酶測定1.7統(tǒng)計分析用軟件SPSS11.0統(tǒng)計各指標均值和方差,并運用GLM程序的方差分析對伊薩雞蛋和京海黃雞蛋蛋清溶菌酶含量和活力進行比較。2結(jié)果與分析2.1溶菌酶標準曲線溶菌酶溶解后經(jīng)紫外-可見分光光度計檢測,在281nm波長處出現(xiàn)峰值。配制不同梯度濃度溶菌酶溶液,每毫升溶液中的溶菌酶含量與281nm波長處吸光度呈線性關系,標準曲線圖形見圖1,標準曲線回歸方程為Y=2.4429X+0.0149,R2=0.9998。2.2綜合密度、精度和靈敏度的結(jié)果2.2.1血清中溶菌酶含量測定精密度一般用相對標準差RSD(即變異系數(shù)CV)表示,RSD越低,則表示方法精密度越好。低、中、高3種濃度(3種濃度蛋清溶液是依據(jù)稀釋倍數(shù)不同,本研究低濃度蛋清稀釋了70倍,中濃度蛋清稀釋了20倍,高濃度蛋清稀釋了10倍)的蛋清溶液中溶菌酶含量的日內(nèi)(上午、下午和晚上)和日間(不同日的同一時間)測定結(jié)果見表2和表3,其中日內(nèi)RSD<3%(2.01%、2.08%、0.80%),日間RSD<4%(3.18%、2.36%、1.46%),3種濃度蛋清溶液的溶菌酶含量測定值日內(nèi)RSD均小于日間RSD。2.2.2溶菌酶測定m通過已知量溶菌酶標準品在蛋清溶液中的加樣回收試驗,用溶菌酶的回收率(R=(M-P)/A×100%其中,M為測得溶菌酶量;M-P為回收溶菌酶量)表示方法的準確度,回收率越接近100%,表示方法準確度越高。以蛋清溶液(由1.2測得P為197.35μg/mL)為溶劑配制200、400、600μg/mL溶菌酶溶液,添加回收率計算結(jié)果見表4,3種濃度溶菌酶的添加回收率都在95%以上。2.2.3測定溶菌酶含量的定量限靈敏度用最低定量濃度(定量限LOQ)和最低檢測濃度(檢測限LOD)2項指標表示。配制一系列低溶菌酶濃度溶液,對每種濃度取樣4次進行測定,定量限測定結(jié)果見表5,當酶濃度降低到4μg/mL時,相對誤差E>20%,因此本方法測定溶菌酶含量的定量限為5μg/mL。以蛋清溶液為溶劑配制一系列低濃度的溶菌酶溶液,蛋清溶液為空白調(diào)零,檢測限測定結(jié)果見表6,當溶菌酶濃度低于0.3μg/mL時,吸光度值不穩(wěn)定,因此本方法測定溶菌酶含量的檢測限為0.3μg/mL。2.3溶菌酶測定結(jié)果測定方法是否穩(wěn)定用重復樣的相對標準差來表示,RSD越小,測定結(jié)果越一致,證明測定方法越穩(wěn)定。蛋清重復樣1~5的溶菌酶含量和活力測定結(jié)果見表7。重復樣的溶菌酶含量RSD為3.03%,活力RSD為6.17%,即本方法所測蛋清溶菌酶含量和活力的RSD都小于7%。2.4蛋清溶菌酶活力2個品種雞蛋蛋清溶菌酶含量和活力的測定結(jié)果見表8。本試驗所測伊薩雞蛋和京海黃雞蛋蛋清溶菌酶平均含量分別為3.47、3.71mg/mL,蛋清溶菌酶平均活力分別為16183.74、15689.35U/mg。伊薩雞蛋較重(P<0.01),蛋清溶菌酶含量顯著低于京海黃雞蛋蛋清溶菌酶含量(P<0.05);伊薩雞蛋蛋清溶菌酶活力略高于京海黃雞蛋蛋清溶菌酶活力,(P>0.05)。3討論3.1溶菌酶的提取途徑測定雞蛋蛋清中的溶菌酶含量的傳統(tǒng)途徑是先提取再測定,從蛋清中分離純化溶菌酶已有不少報道,雖然正交試驗的酶回收率可達94%,但是再精確的提取途徑也無法完全提取出蛋清中的溶菌酶。本方法測定蛋清中的溶菌酶含量精密度(RSD<4%)、準確度(R>95%)、靈敏度(LOQ5μg/mL,LOD0.3μg/mL)、可重復性(RSD<7%)均符合方法評估實驗要求,所測2個品種雞蛋蛋清溶菌酶含量(2.93~4.07mg/mL)與相關研究結(jié)果基本一致,且本方法測定過程不涉及提取,測定周期短,對酶的活力影響小。3.2s至65s的時間酶的活力表示為特定條件下單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化底物的速度,試驗過程中,每5s記錄1次測定管的吸光度值,在15s至75s之間測定管吸光度值以穩(wěn)定速度下降,因此單位時間選擇為15s至75s,該時間段的選擇在文獻中亦有描述。2個品種雞蛋蛋清溶菌酶活力測定結(jié)果(13832.54~20842.74U/mg)與以往研究一致。溶菌酶活力的測定方法很多,其中比濁法是一直沿用至今的經(jīng)典方法,本方法借鑒了前人在比濁法上的研究成果,改進酶活力的測定條件,縮短了測定時間(1min),運用本方法大批量、不定時測定蛋清中的溶菌酶活力時,為了節(jié)省每次測定培養(yǎng)溶壁微球菌的時間,可以把培養(yǎng)好的溶壁微球菌用20%的甘油作為保護劑,放入冰箱-20℃下保存,每次測定時稱取少許菌和甘油的混合物制成底物即可使用。4消溶酶活力測定方法本方法用紫外-可見分光光度計,在不需要提取溶菌酶的情況下直接測定蛋清中的溶菌酶含量,測定周期短,對酶活力影響小,方法穩(wěn)定可靠;改進了經(jīng)典比濁法酶活力的測定條件,縮短了測定時間,尤其在大批量、不定時測定雞蛋蛋清中的溶菌酶活力時,減少測定成本。本研究為家禽蛋清中溶菌酶的測定提供了一套操作性強、易于掌握、結(jié)果可靠穩(wěn)定的方法,本測定雞蛋蛋