膜片鉗技術(shù)在心血管藥理學(xué)中的應(yīng)用

膜片鉗技術(shù)在心血管藥理學(xué)中的應(yīng)用

膜片移植技術(shù)是利用分子水平了解生物膜離子通道門的動(dòng)態(tài)特征、滲透性、選擇性和其他膜信息，提供最直接的方法，使人們對(duì)膜通道功能的理解進(jìn)入一個(gè)新的水平，也是心血管研究方法的創(chuàng)新進(jìn)步。1976年，neher和sakman首次報(bào)告了膜片移植技術(shù)對(duì)單個(gè)膜塊的電流進(jìn)行了記錄。在過去的20年里，該技術(shù)被廣泛使用，促進(jìn)了細(xì)胞和細(xì)胞膜的發(fā)展。心血管的研究也離不開膜片移植技術(shù)。其特點(diǎn)和基本原則與經(jīng)典微電極技術(shù)相似，但記錄了不同的膜離子流，它們是以四種形式記錄的。例如，將細(xì)胞吸附在一起，外部瓣膜記錄，外部瓣膜記錄和全細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)。膜片夾技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使人們對(duì)心血管藥理學(xué)的研究更加深入，對(duì)疾病和藥物的作用認(rèn)識(shí)不斷更新，在疾病、病因和藥理學(xué)方面提出了許多新觀點(diǎn)。本文主要介紹了膜片移植在心血管藥理學(xué)研究中的應(yīng)用。1膜片移植技術(shù)在心血管藥理學(xué)研究中的應(yīng)用1.1u3000kispt-pcr的抗心肌缺血作用自1983年在心肌細(xì)胞膜上首次發(fā)現(xiàn)ATP敏感的鉀通道(KATP)以來,KATP在心肌缺血損傷的病理生理機(jī)制中的作用越來越引起了人們的關(guān)注.實(shí)驗(yàn)證明在生理?xiàng)l件下,心肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度為毫摩爾水平,這一濃度能明顯抑制KATP通道.ATP/ADP比率輕度變化時(shí),只有為數(shù)很少的KATP通道開放.因此,在生理?xiàng)l件下KATP通道未必起作用.但在缺血和其他代謝抑制的情況下,KATP通道即被明顯激活.據(jù)李翠蘭等首次直接觀察到心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)可導(dǎo)致KATP通道在預(yù)適應(yīng)末及隨后長(zhǎng)時(shí)間缺血早期的適度激活,但不影響長(zhǎng)時(shí)間缺血晚期和再灌注過程中的開放程度,為進(jìn)一步研究IPC的發(fā)生機(jī)制預(yù)先給予格列苯脲可加重缺血再灌注損傷,然而,急性心肌缺血時(shí)KATP通道激活所致的細(xì)胞外鉀堆積是誘發(fā)嚴(yán)重室性心律失常的主要原因.因此,KATP通道激活也有其不利的方面.彭俊等試驗(yàn)表明,二乙?；徯膲A可濃度依賴性阻滯兔心室肌細(xì)胞的瞬時(shí)外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流.馬玉萍等試驗(yàn)表明,多非替利衍生物CPU86017對(duì)分離的單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞緩慢激活(Iks)具有濃度、時(shí)間依賴性和電壓依賴性阻斷作用.王志勇等試驗(yàn)表明,瞬時(shí)外向電流(Ito)及內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)是參與心臟動(dòng)作電位復(fù)極化的主要膜電流,槲寄生黃酮苷抑制Ito和Ik1的內(nèi)向成分影響動(dòng)作電位復(fù)極過程,可使心肌復(fù)極化過程減慢,動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng),進(jìn)而延長(zhǎng)有效不應(yīng)期,是其抗心律失常作用的重要機(jī)制.1.2對(duì)l-型鈣通道的抑制作用哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞膜去極化時(shí),細(xì)胞外液Ca2+由鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),啟動(dòng)細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián).由于Ca2+通過鈣通道內(nèi)流是細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)的首要條件,因此研究Ca2+和鈣通道及其調(diào)控為進(jìn)一步闡明興奮收縮耦聯(lián)機(jī)制具有重要意義.錢衛(wèi)民等試驗(yàn)觀察到丹參素能使豚鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣通道電流-電壓曲線明顯上移,不改變激活和反轉(zhuǎn)電位,對(duì)不同電壓最大激活鈣電流的穩(wěn)定激活和失活曲線也無影響.丹參素對(duì)L-型鈣通道電流具有明顯的阻斷作用,具有類似異搏停樣L-型鈣通道阻斷劑作用.謝世榮等試驗(yàn)結(jié)果表明,甘草次酸通過阻滯心室肌細(xì)胞膜L-型鈣通道抑制鈣離子內(nèi)流,這種機(jī)制可能與甘草次酸抗心律失常作用有關(guān).1.3膜片鉗在心肌生理及病理生理中的應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的一大優(yōu)點(diǎn)就是在通道電流記錄中,可分別于不同時(shí)間、不同部位(膜內(nèi)或膜外)施加各種濃度的藥物或毒素,研究它們對(duì)通道功能的可能影響.通過研究,一方面可深入了解哪些選擇性作用于通道的藥物和毒素影響人和動(dòng)物生理功能的分子機(jī)理;另一方面,分析各種藥物對(duì)通道蛋白的選擇性相互作用的特點(diǎn),提供有關(guān)通道蛋白亞單位結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的信息.近十年來心血管藥物學(xué)研究重要的成就就是各種藥物對(duì)心血管的影響.首先是各類抑制心肌L-型離子通道的藥物(如丹參素、甘草次酸、大豆肽、大蒜素、CPU86017、多非替利衍生物CPU228);其次是導(dǎo)致心律失常的因素(如血小板活化因子、缺氧);趙新然等試驗(yàn)證明溴芐基四氫小檗堿對(duì)正常豚鼠心室肌細(xì)胞鉀電流(IK)及L-型鈣電流ICa-L均有阻斷作用,這種多離子通道的阻斷劑可有效抗快速心律失常,并且不會(huì)引起動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期的過度延長(zhǎng),從而減少藥物的致心律失常作用;再次是保護(hù)心肌、抗心肌缺血和心肌梗死的藥物(如三七、丹參、當(dāng)歸、人參、連心堿)、中藥鈣激動(dòng)劑紅花黃素和錢子堿.侯炳軍發(fā)現(xiàn)微量元素對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用.1.3.1與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道心肌細(xì)胞通過各種離子通道對(duì)膜電位和動(dòng)作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能.近年來,學(xué)者們?cè)谌祟愋募〖?xì)胞離子通道特性的研究中取得了很多進(jìn)展,使得心肌藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)由動(dòng)物細(xì)胞模型轉(zhuǎn)向人心肌細(xì)胞成為可能.目前利用膜片鉗技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究所涉及的主要離子通道有以下4種.1.3.1.1快鈉通道(INa)快鈉通道能夠去極化,傳播動(dòng)作電位,對(duì)維持細(xì)胞興奮性及正常生理功能有主要作用.鄧春玉等試驗(yàn)證明,卡維地洛能夠抑制心肌細(xì)胞鈉通道電流,呈濃度依賴性和頻率依賴性.鄧春玉等試驗(yàn)證明,葛根素能濃度依賴性地增加心肌鈉通道電流.歐陽平等證明,新型重組?？舅豩k2a對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉通道的時(shí)間依賴性失活的減慢,是hk2a對(duì)心臟具有正性肌力效應(yīng)的重要機(jī)制.1.3.1.2鈣通道心肌的興奮與收縮與心肌細(xì)胞鈣離子通道密切相關(guān).目前膜片鉗技術(shù)已在心肌細(xì)胞上記錄到L、T和B型電壓依賴性鈣通道上.L-型通道目前研究得最多,心肌以持久開放、失活緩慢占優(yōu)勢(shì),具有電壓、時(shí)間依賴性.單通道電導(dǎo)較大,激活電壓T型是正40mV左右.T型通道開放時(shí)間較短,單通道電導(dǎo)小,多在階躍命令早期開放,膜電位-50mV時(shí)失活,T型電流不易記錄.B型通道有自發(fā)開放和明顯電壓依賴性特點(diǎn).荊玉紅等證明,鵪鶉心室肌細(xì)胞上存在著L-型鈣電流,此電流為構(gòu)成鵪鶉心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的重要電流之一.鄧春玉等試驗(yàn)表明,H2O2可以增加大鼠心肌細(xì)胞Ica-L,且使其失活明顯減慢.單宏麗等證明,預(yù)先應(yīng)用紅花黃素對(duì)H2O2損傷有一定的拮抗作用,說明其能夠清除氧自由基,為臨床應(yīng)用治療缺血性心臟病提供理論依據(jù).鄧春玉等證明,氯胺酮對(duì)心肌細(xì)胞膜L-型鈣通道具有抑制作用,其抑制程度有濃度依賴性.張斌等證明,三七皂甙單體Rg1對(duì)L-型鈣通道無抑制作用.1.3.1.3鉀通道鉀通道種類最多,它通過調(diào)節(jié)膜電位而降低組織興奮性,阻抗去極化,影響動(dòng)作電位的頻率及時(shí)程,因而能夠在不同的時(shí)程和電位水平精確調(diào)控細(xì)胞靜息膜電位和動(dòng)作電位.目前已經(jīng)能夠根據(jù)不同的通道敏感阻斷藥物和各自不同的激活/失活電位進(jìn)行鑒別和區(qū)分.主要有:①內(nèi)向整流鉀電流(inwardrectifierpotassiumcurrent,IK1),因其內(nèi)向整流特性而得名,又稱背景鉀電流.在維持靜息膜電位和快速?gòu)?fù)極過程中有主要作用.有時(shí)間依賴性激活和失活特點(diǎn).IK1在超極化時(shí)激活,激活的電壓范圍隨胞外鉀濃度變化而變化,表現(xiàn)為純的K+內(nèi)流.Koumi等注意到人心室細(xì)胞通道IK1的密度及電流幅度均大于心房細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)IK1的變特點(diǎn)在擴(kuò)張性和缺血性病變的心室肌細(xì)胞間有明顯不同.②延遲整流鉀電流(delayedrectifierpotassiumcurrent,Ik)是心肌細(xì)胞去極化時(shí)激活的外向鉀電流,其激活有電壓和時(shí)間依賴性,是3期復(fù)極的主要離子流.目前根據(jù)分子生物學(xué)及通道動(dòng)力學(xué)差異分為3種類型,即延遲整流快成分rapidIK,IKr,延遲整流慢成分(slowIK,IKs)和人心房肌延遲整流超速激活型成分(ultra-rapiddelayedrectifierK+current,IKr).而IKs和IKr均可成為抗心律失常藥的靶位.瞬間外向鉀電流(transientoutwardpotassiumcurrent,Ito)在去極化早期出現(xiàn),為動(dòng)作電位的早期復(fù)極化電流.其特點(diǎn)在人及動(dòng)物心肌細(xì)胞依種屬、組織而有差異,但均有電壓依賴性快速激活和迅速滅活的特點(diǎn).Ito又分為2種成分:Ito1為電壓依賴性,對(duì)鉀通道阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP)敏感.Ito2對(duì)4-AP相對(duì)不敏感.劉玉梅等試驗(yàn)證明,甲醇降低動(dòng)作電位幅度,縮短動(dòng)作電位時(shí)程,影響心肌正常工作,可能與它對(duì)心肌細(xì)胞鉀通道的作用有關(guān).黃愛杰等證明,利多卡因可以明顯阻滯大鼠心室肌的瞬時(shí)外向鉀電流.劉玉梅等證明,延胡索乙素抗心律失常作用機(jī)制可能與它對(duì)心肌細(xì)胞鉀通道作用有關(guān),延胡索乙素可抑制Ik和Ik1,使動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)延長(zhǎng)從而發(fā)揮其抗心律失常作用.吳輝等試驗(yàn)證明,心肌肽素抑制豚鼠心室肌細(xì)胞Ik1,可能是其抗心律失常作用的機(jī)理之一.1.3.1.4其它通道其它通道與心肌電生理、藥理、病理生理關(guān)系密切的還有Na+-Ca2+交換電流、Na+-K+泵電流、細(xì)胞質(zhì)膜鈣ATP酶和肌漿網(wǎng)Ca2+泵、氯離子通道、第二信使門控鈣通道(second-messenger-operatedCa2+channels,SMOCs)及配體依賴性通道等其它通道類型,共同決定著心肌細(xì)胞的功能狀態(tài).隨著膜片鉗技術(shù)的不斷完善,可能會(huì)新發(fā)現(xiàn)更多的離子通道類型,并闡明其結(jié)構(gòu)與功能.膜片鉗技術(shù)以其實(shí)用、快速、靈敏、準(zhǔn)確及重復(fù)性好等技術(shù)優(yōu)勢(shì)已經(jīng)在大量的研究中得到證實(shí).這一技術(shù)發(fā)明至今已有20多年歷史,國(guó)外20世紀(jì)80年代中期用此技術(shù)進(jìn)行研究并推廣,國(guó)內(nèi)20世紀(jì)90年代初引進(jìn)這一技術(shù).但國(guó)內(nèi)目前由于多種原因用此技術(shù)進(jìn)行心血管藥物與心肌細(xì)胞離子通道的研究多停留在動(dòng)物細(xì)胞階段.種屬及組織差異使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與臨床的聯(lián)系上還有一段距離,亟待采用同種動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大量的研究,這也是今后藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域.2003年JoseJalife等在關(guān)于(人)VF分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)的文章中敘述,對(duì)豚鼠VF模型的光譜分析數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)模擬顯示,左心室(LV)與右心室(RV)細(xì)胞中內(nèi)向整流鉀通道電流(IK1)的濃度差是VF的原因.電壓閘門、河豚毒素敏感性鈉電流(INa)在螺旋波折返的穩(wěn)定中起到了主要作用.螺旋波折返的穩(wěn)定是VF等心律失常的生物電基礎(chǔ).二氫蝶啶敏感性鈣電流(ICa)阻滯可將VF轉(zhuǎn)換為室性心動(dòng)過速(VT).心臟中存在著一些對(duì)折返性心律失常敏感的心肌組織.這些敏感的心肌組織與不敏感的心肌組織生物電的差異,是導(dǎo)致VF的原因.而正常的心肌生物電是Na1+、K1+、Ca2+等離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)形成的,因此,不同部位心肌細(xì)胞跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的差異是形成VF等心律失常的基礎(chǔ).最近一些學(xué)者的研究結(jié)果表明