谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝（發(fā)酵技術(shù)課件）

生產(chǎn)菌種工藝控制染菌防治綜合實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目五谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌種谷氨酸短棒桿菌棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。Oα-酮戊二酸乙酰CoA（C2）草酰乙酸（C4）檸檬酸（C6）α-酮戊二酸（C5）琥珀酸（C4）谷氨酸CO2谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸脫氫酶NH4＋NADPH×CO2葡萄糖丙酮酸α-氨基戊二酸EMP途徑CO2問(wèn)題：消耗的草酰乙酸如何補(bǔ)充？代謝途徑谷氨酸產(chǎn)生菌株的生化特點(diǎn)：①α-酮戊二酸脫氫酶活性極低或缺失為什么？菌種特點(diǎn)③細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高為什么？（不被高濃度的谷氨酸抑制）葡萄糖丙酮酸a－酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4＋抑制葡萄糖EMP途徑TCA循環(huán)中NADPH②谷氨酸脫氫酶活性很高為什么？（不被低濃度的谷氨酸抑制）進(jìn)行菌種篩選！問(wèn)題：如何提高細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性？生物素：脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸的合成。生長(zhǎng)因子改造后的生產(chǎn)菌種：生物素缺陷型谷氨酸短棒桿菌菌種改造完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基即維生素H、輔酶R，一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲?；^(guò)程的輔酶，是羧化、脫羧、脫氫反應(yīng)酶系的輔酶因子，參與機(jī)體三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝。當(dāng)生物素不足時(shí)：不利于不飽和脂肪酸的合成，從而造成細(xì)胞膜成分磷脂的不足，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組成不完全，因而增加了細(xì)胞膜的通透性，有利于谷氨酸滲出膜外。影印法篩選生物素缺陷型，限量供給生物素（亞適量），使細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸有良好的通透性。種子擴(kuò)大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)——主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬生長(zhǎng)特點(diǎn)：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長(zhǎng)因子。一級(jí)種子培養(yǎng)——搖瓶機(jī)上振蕩培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)——種子罐培養(yǎng)料液量為發(fā)酵罐投料體積的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃進(jìn)行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：無(wú)雜菌污染，菌體大小均一，呈單個(gè)或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109/ml。菌種擴(kuò)培工藝控制谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝①通風(fēng)（供氧）：菌體生長(zhǎng)階段：通風(fēng)量過(guò)大，生物素缺乏，抑制菌體生長(zhǎng)。發(fā)酵產(chǎn)酸階段：需要大量通風(fēng)供氧；但過(guò)大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸；通風(fēng)不足，則過(guò)量生成乳酸、琥珀酸。長(zhǎng)菌期低風(fēng)量、產(chǎn)酸期高風(fēng)量、成熟期低風(fēng)量②

NH4+

和pH（中性或弱堿性）谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過(guò)高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過(guò)低氨離子不足。通過(guò)添加NH4+同時(shí)調(diào)節(jié)pH種子罐搖瓶補(bǔ)料罐；尿素空氣分過(guò)濾器①氧②NH4+③pH發(fā)酵罐④生物素亞適量空氣總過(guò)濾器通風(fēng)NH4+pH谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝③生物素：控制在亞適量：2～3μg/L。當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過(guò)量：則發(fā)酵過(guò)程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多；生物素不足：抑制菌體生長(zhǎng)④溫度：三級(jí)控制溫度生物素012h24h32~34℃32～33℃34～36℃谷氨酸生產(chǎn)發(fā)酵罐防止噬菌體和雜菌的污染染菌原因噬菌體防控生產(chǎn)和試驗(yàn)過(guò)程中活生產(chǎn)菌到環(huán)境中環(huán)境中的噬菌體噬菌體大量增殖傳播風(fēng)沙、塵土、空氣生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)潛入尤其是通過(guò)空氣系統(tǒng)進(jìn)入種子室、種子罐、發(fā)酵罐染菌危害噬菌體的感染力很強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。防止噬菌體和雜菌的污染染菌表現(xiàn)噬菌體防控染菌檢測(cè)雙層平板法1）鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，且在短時(shí)間內(nèi)菌體大量自溶。2）發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時(shí)之內(nèi)可達(dá)8.0以上，不再下降；殘?zhí)巧摺槭裁矗?）發(fā)酵液突然稀薄，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4）產(chǎn)物生成量甚少或增長(zhǎng)緩慢或停止.有無(wú)染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗(yàn)在培養(yǎng)皿上倒入滅菌培養(yǎng)基作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過(guò)夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。下層：無(wú)菌培養(yǎng)基上層：培養(yǎng)基＋種子液＋發(fā)酵液（可疑）防止噬菌體和雜菌的污染染菌防治噬菌體防控染菌處理1）必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃；2）車(chē)間地面和通往車(chē)間的道路盡量采取水泥地面以減少灰塵；3）種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作規(guī)程，認(rèn)真地進(jìn)行種子保管；4）發(fā)酵罐、補(bǔ)料系統(tǒng)滅菌要徹底。嚴(yán)格控制逃液和取樣分析和洗罐所廢棄的菌體。對(duì)倒罐所排放的廢液應(yīng)滅菌后才可排放。5）選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種；為什么？1）環(huán)境：車(chē)間四周有嚴(yán)重污染噬菌體的地方應(yīng)及時(shí)撒石灰或漂白粉；2）發(fā)酵：發(fā)現(xiàn)噬菌體停止攪拌、小通風(fēng)，將發(fā)酵液加熱到70℃~80℃殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周?chē)墓艿酪脖仨殢氐诇缇?）廢液：嚴(yán)格控制逃液、樣液和洗罐所廢棄的菌體。對(duì)倒罐所排放的廢液應(yīng)滅菌后才可排放。發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)菌種易染雜菌谷氨酸短棒桿菌噬菌體檸檬酸黑曲霉青霉菌抗生素放線(xiàn)菌、霉菌短桿菌，產(chǎn)氣桿菌，假單孢菌酒類(lèi)釀酒酵母野生酵母，醋酸菌、乳酸菌酒精酵母菌醋酸菌，乳酸菌染菌防治檢查方法（1）顯微鏡檢查：染色→鏡檢無(wú)法發(fā)現(xiàn)染菌初期的雜菌，為什么？（2）無(wú)菌試驗(yàn)取樣1次/8h；檢查1次/6h①平板劃線(xiàn)檢查（雙碟法）：倒平板→空培養(yǎng)→待測(cè)樣品劃線(xiàn)→培養(yǎng)觀察②酚紅肉湯培養(yǎng)檢查：無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基空培養(yǎng)→接入樣品→培養(yǎng)觀察③雙層平板法：用于檢查噬菌體（3）通過(guò)發(fā)酵的生理生化指標(biāo)檢查（4）試劑盒檢驗(yàn)法檢查方法檢查方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)顯微鏡檢查簡(jiǎn)便、快速取樣少，視野小，不易檢出早期雜菌培養(yǎng)法可檢出早期雜菌較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，且操作較繁瑣生理生化指標(biāo)檢查可及早發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)染菌需建模試劑盒檢驗(yàn)快速、高效、專(zhuān)一性強(qiáng)費(fèi)用高方法比較檢查原則實(shí)驗(yàn)為主，鏡檢為輔：檢查結(jié)果以平板劃線(xiàn)和肉湯培養(yǎng)結(jié)果為主要根據(jù)平板劃線(xiàn)和肉湯培養(yǎng)應(yīng)做三個(gè)平行樣；定時(shí)取樣、定時(shí)觀察：取樣1次/8h；檢查1次/6h酚紅肉湯和平板劃線(xiàn)培養(yǎng)樣品應(yīng)保存至放罐后12小時(shí)，確定為無(wú)菌時(shí)方可棄去要嚴(yán)格的無(wú)菌操作，取樣時(shí)防止外界雜菌混入的措施。染菌的主要途徑：1.原料方面：滅菌不徹底2.種子方面：種子帶菌3.無(wú)菌空氣：空氣帶菌4.補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料或管路帶菌5.設(shè)備方面：設(shè)備滲漏主要途徑2種子罐2搖瓶4補(bǔ)料罐3空氣總過(guò)濾器3空氣分過(guò)濾器2斜面5設(shè)備管道1發(fā)酵罐原料染菌的主要途徑：1.原料方面：滅菌不徹底2.種子方面：種子帶菌3.無(wú)菌空氣：空氣帶菌4.補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料或管路帶菌5.設(shè)備方面：設(shè)備滲漏防治措施發(fā)酵染菌的防治措施：1.培養(yǎng)基滅菌徹底2.杜絕種子帶菌3.防止無(wú)菌空氣帶菌3.補(bǔ)料滅菌徹底5.防止發(fā)酵設(shè)備的死角與滲漏6.嚴(yán)格操作管理（人為因素）染菌的處理（挽救）原則：1、對(duì)染菌的種子培養(yǎng)基處理：一般均應(yīng)滅菌后堅(jiān)決棄去，并對(duì)接觸過(guò)的設(shè)備，管道全部滅菌，加長(zhǎng)滅菌時(shí)間等。2、對(duì)染菌的發(fā)酵培養(yǎng)基處理：發(fā)酵前期染菌（最易染菌，且危害最大）應(yīng)迅速再次滅菌，補(bǔ)充必要營(yíng)養(yǎng)成分，重新接種；發(fā)酵中期染菌（染菌機(jī)會(huì)較?。褐饕ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)工藝條件來(lái)挽救，如降低發(fā)酵溫度；減少補(bǔ)料等。發(fā)酵后期染菌（不易染菌）：應(yīng)提前放罐，或者加入一些殺菌劑（如抗生素）來(lái)抑菌。3、對(duì)染菌后的設(shè)備處理：用甲醛熏蒸、蒸汽消毒處理挽救案例分析：某藥廠進(jìn)行抗生素發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵原料補(bǔ)充采購(gòu)時(shí)，其中一種原料批號(hào)更換，結(jié)果在隨后近半年時(shí)間內(nèi)，發(fā)酵生產(chǎn)期間經(jīng)常間歇性污染芽孢桿菌，但是在接種之前檢查菌種液時(shí)并無(wú)異常發(fā)現(xiàn)，多次檢查生產(chǎn)設(shè)備均無(wú)問(wèn)題，給生產(chǎn)造成極大影響。請(qǐng)問(wèn)染菌的原因可能是哪些方面？如果檢查結(jié)果是：①滅菌壓力和溫度正常；②工具包裝及滅菌時(shí)間正常；③操作間塵降菌符合要求；④空氣過(guò)濾系統(tǒng)正常；⑤補(bǔ)料系統(tǒng)正常；⑥員工操作無(wú)誤。那么，你認(rèn)為最有可能的染菌原因是什么？為什么？綜合實(shí)訓(xùn)（一周）菌種：谷氨酸產(chǎn)生菌BL-115或其他高產(chǎn)菌種（購(gòu)買(mǎi)）菌種擴(kuò)培結(jié)束放罐清潔整理休眠狀態(tài)活化10支/班種子培養(yǎng)基1000ml；分裝于20個(gè)250ml三角瓶中，每瓶裝量50ml發(fā)酵培養(yǎng)基30-35L罐容量50L放出發(fā)酵液，用于產(chǎn)品提取清洗發(fā)酵罐等菌種擴(kuò)培總計(jì)時(shí)：60h（實(shí)驗(yàn)員活化；一級(jí)種子培養(yǎng)星期一——星期二）培養(yǎng)48h32℃冷藏菌種新制斜面一級(jí)種子接種生產(chǎn)250rpm振蕩培養(yǎng)32℃12h發(fā)酵生產(chǎn)32-34℃，,36h菌種擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)罐滅菌操作：檢查設(shè)備清洗標(biāo)定電極加入30-35L發(fā)酵培養(yǎng)基（預(yù)先配好）蒸汽預(yù)熱加熱滅菌冷卻待用實(shí)罐滅菌50L機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐主控機(jī)柜蒸汽、冷卻水、排污等管道接種——火焰圈接種法取空白樣——接種前取0號(hào)樣——接種后立即取樣離線(xiàn)檢測(cè)0號(hào)樣——?dú)執(zhí)恰D值（菌體濃度）、鏡檢（菌體形態(tài)）在線(xiàn)監(jiān)控參數(shù)——溶氧、溫服、pH值、泡沫等發(fā)酵生產(chǎn)每次取樣液約50-60ml發(fā)酵生產(chǎn)

上罐實(shí)消配制發(fā)酵培養(yǎng)基

冷卻接種

固體斜面培養(yǎng)菌種

三角瓶振蕩培養(yǎng)

發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程參數(shù)控制DO值

pH

溫度

泡沫發(fā)酵過(guò)程參數(shù)監(jiān)測(cè)還原糖的測(cè)定谷氨酸含量的測(cè)定（略）*菌體形態(tài)觀察菌體濃度測(cè)定