大蒜總皂苷大孔樹脂純化工藝研究

大蒜總皂苷大孔樹脂純化工藝研究

總體上磺酸是大蒜的一個有效成分之一。它具有降脂、抗凝劑、抗癌、抗菌等作用。其糖苷的類型為脂肪醇酸和胸糖酸。目前，已分離并確認了10種磺酸和7種螺旋劑。目前,大蒜總皂苷的提取原料多為脫水蒜粉,一般用體積分數(shù)40%～80%的乙醇提取。本實驗以生大蒜為原料,充分利用大蒜提取揮發(fā)油后的蒜渣,雙提后乙醇提取,經(jīng)樹脂純化,使提取物中大蒜總皂苷純度>50%,符合中藥五類新藥申報的要求。1儀器和儀器SPS202F型電子天平(奧豪斯公司),DS200型高速組織搗碎機(江蘇江陰周莊科研器械廠),揮發(fā)油提取器(北京玻璃儀器廠),98-1-B型電熱套(天津泰斯特儀器有限公司),8453型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫),P225D型電子天平(德國賽多利斯),HY-4A型數(shù)顯調(diào)速多用振蕩(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。大蒜(山東金鄉(xiāng),經(jīng)山東金鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)局程堂高級農(nóng)技師鑒定為百合科植物大蒜AlliumsativumL.的鱗莖)AB-8,D4020,S-8型大孔樹脂(天津南開大學化工廠),DM-130,CD-180型大孔樹脂(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司),HPD-100型大孔樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司),薄層色譜板(青島海洋化工廠分廠),皂苷對照品(Proto-iso-eruboside-B,實驗室自制,純度>98%)。2方法和結果2.1總皂苷的提取和純化分別取已處理好的6種大孔吸附樹脂,抽濾至不滴水為準,各稱取50g(W),濕法裝于3.2cm×40cm玻璃柱中。按優(yōu)選的工藝進行提取,調(diào)整藥液生藥質(zhì)量濃度1.79g·mL-1,測定總皂苷質(zhì)量濃度(C0)。取6份提取液,每份60mL(V0),上樣流速2BV·h-1,收集流出液,用500mL蒸餾水洗脫,水洗液與流出液合并(V1),各樹脂柱均繼續(xù)用700mL95%乙醇以2BV·h-1洗脫,收集醇洗脫液(V2),測定水洗液與醇洗液中總皂苷濃度(分別為C1,C2),見表1,結果表明采用AB-8型大孔樹脂純化大蒜總皂苷的轉(zhuǎn)移率最高。吸附量=(C0×V0-C1×V1)/W;吸附率=[(C0×V0-C1×V1)/C0×V0]×100%;洗脫量=C2×V2/W;洗脫率=[C2×V2/(C0×V0-C1×V1)]×100%;轉(zhuǎn)移率=(C2×V2)/(C0×V0)×100%2.2大孔樹脂吸附性能的研究2.2.1總皂苷泄漏率稱取AB-8型大孔樹脂50g,濕法裝柱。取大蒜提取液(1.82g·mL-1)以2BV·h-1上樣,分段收集流出液(1～10份,每份9mL;11～19份,每份27mL),測定上樣液及各流出液中總皂苷質(zhì)量濃度,以生藥量-樹脂量為橫坐標,總皂苷泄漏率(流出液質(zhì)量濃度/上樣液質(zhì)量濃度)為縱坐標,繪制吸附曲線,見圖1。由圖1可知,當上樣生藥量達樹脂量的1.33倍時,總皂苷泄漏率達8.34%。當泄漏率為10%時,可認為達到穿透點,故確定每100gAB-8型大孔樹脂可吸附130g大蒜的提取液。2.2.2水洗液與醇洗液中總皂苷的轉(zhuǎn)移率測定是一個表1,2稱取AB-8型大孔樹脂50g,濕法裝柱。取大蒜提取液(1.60g·mL-1)5份,每份42mL,分別用水稀釋成1.6,1.2,0.8,0.4,0.1g·mL-1的藥液,以2BV·h-1上樣,用500mL水洗脫,水洗液與流出液合并,用95%乙醇5BV洗脫,收集乙醇洗脫液,測定水洗液與醇洗液中總皂苷質(zhì)量濃度,見表2,結果表明當上樣液質(zhì)量濃度為0.8g·mL-1時,總皂苷的轉(zhuǎn)移率最高。2.2.3ph測定和ph的調(diào)節(jié)稱取AB-8型大孔樹脂50g,濕法裝柱。取大蒜提取液(0.8g·mL-1)3份,每份83mL,用pH試紙測定藥液pH7.0,其他兩份藥液分別用稀HCl和5%NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0,10.0。按2.2.2項下方法上樣,依次用水和95%乙醇洗脫,測定水洗液與醇洗液中總皂苷質(zhì)量濃度,見表3,結果表明當藥液pH7.0時,皂苷轉(zhuǎn)移率最高。2.2.4水洗液與醇洗液中總皂苷的轉(zhuǎn)移率稱取AB-8型大孔樹脂50g,濕法裝柱。取大蒜提取液(0.8g·mL-1)3份,每份83mL,分別以2,4,6BV·h-1上樣,按2.2.2項下方法依次用水、95%乙醇洗脫,測定水洗液與醇洗液中總皂苷質(zhì)量濃度,見表4,結果表明當流速為2BV·h-1時,總皂苷轉(zhuǎn)移率最高。2.3大孔樹脂洗脫性能研究2.3.1洗脫溶劑及洗脫物的篩選稱取AB-8型大孔樹脂500g,裝于4cm×100cm玻璃柱中。取大蒜提取液(0.8g·mL-1)831mL,按優(yōu)選的吸附工藝上樣,依次用水及體積分數(shù)10%,30%,50%,70%,95%的乙醇各4BV梯度洗脫,分段收集洗脫液,每份1BV。樣品進行TLC檢識,減壓干燥,測定各樣品中總皂苷質(zhì)量,以洗脫溶劑為橫坐標,總皂苷質(zhì)量分數(shù)為縱坐標,繪制洗脫曲線見圖2,TLC檢識見圖3。由圖3可知,大蒜總皂苷樣品主要集中在50%～95%的乙醇洗脫物中。圖2表明10%乙醇洗脫樣品中總皂苷質(zhì)量分數(shù)很低,僅5.50%,故可將10%乙醇洗脫樣品作為雜質(zhì)舍棄;30%乙醇洗脫樣品中大蒜總皂苷質(zhì)量分數(shù)24.62%,因此,進一步利用藥效學試驗確定是否收集此部分洗脫樣品。采用人胃癌MKN45,AGS,HGC-27細胞,對3個不同樣品進行藥效學比較。樣品1為提取液上樣后經(jīng)5BV水洗除雜后,30%乙醇7BV的洗脫產(chǎn)物;樣品2為30%乙醇洗脫后,95%乙醇4BV的洗脫產(chǎn)物;樣品3為提取液上柱后經(jīng)5BV水洗除雜后,95%乙醇4BV的洗脫產(chǎn)物。各樣品對胃癌細胞的半數(shù)殺傷濃度(IC50)見表5,結果表明樣品2藥效活性最強,故確定洗脫工藝為藥液上樣后用30%乙醇洗脫除雜,用95%乙醇洗脫,收集洗脫液。2.3.2膏率、脫除雜的測定稱取AB-8型大孔樹脂100g,濕法裝柱。取大蒜提取液(0.8g·mL-1)3份,每份162.5mL,按優(yōu)選的吸附工藝上樣,用4BV30%乙醇以2BV·h-1洗脫除雜,分段收集流出液,每份1BV,回收溶劑,減壓干燥,計算出膏率;繼續(xù)用7BV95%乙醇以2BV·h-1洗脫,分段收集流出液(1～5份,每份0.2BV;6～10份,每份1BV),回收溶劑,減壓干燥,計算出膏率,并測定每份樣品中總皂苷含量,結果表明3BV30%乙醇可將99%雜質(zhì)除去,5BV95%乙醇可將97%總皂苷洗脫完全。見圖4。2.3.3洗脫溫度和時間對總皂苷轉(zhuǎn)移率的影響稱取AB-8型大孔樹脂100g,濕法裝柱。取大蒜提取液(0.8g·mL-1)3份,每份162.5mL,按優(yōu)選的吸附工藝上樣,用3BV30%乙醇以2BV·h-1流速除雜,用5BV95%乙醇洗脫,洗脫流速分別為1,2,3,4,5BV·h-1,收集各流出液,測定各樣品中總皂苷含量,計算總皂苷轉(zhuǎn)移率分別為27.34%,29.16%,29.28%,28.97%,25.92%,表明以3BV·h-1洗脫時,總皂苷轉(zhuǎn)移率最高。2.4不同純化工藝條件下總皂苷質(zhì)量分數(shù)取大蒜3份,每份150g,按優(yōu)選的提取及純化工藝進行試驗,減壓回收,測得樣品中總皂苷質(zhì)量分數(shù)分別為65.51%,65.31%,69.19%,說明該工藝穩(wěn)定,樣品質(zhì)量可控。2.5中試試驗結果稱取大蒜3份,每份200kg,按優(yōu)選的工藝進行中試試驗,結果3批樣品中總皂苷質(zhì)量分數(shù)分別為70.81%,69.14%,76.91%,表明優(yōu)選的純化工藝穩(wěn)定可行,可推廣使用。3樹脂靜態(tài)篩選試驗采用靜態(tài)法篩選大孔樹脂型號時,發(fā)現(xiàn)不同類型的大孔樹脂吸附、解吸能力均有差別,本試驗以總皂苷轉(zhuǎn)移率為評價樹脂的吸附與解吸綜合能力的指標。靜態(tài)篩