天麻種子萌發(fā)菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)萌發(fā)效果研究

天麻種子萌發(fā)菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)萌發(fā)效果研究

天麻是一種稀有的傳統(tǒng)中醫(yī)。它屬于蘭花科多年生共生草本植物。沒有根和綠色的葉子，所以你不能進行光合作用和自我完善。天麻種子細小如粉塵,無胚乳及其他營養(yǎng)貯備,如無外源營養(yǎng)供給,種子不能發(fā)芽,必需依靠小菇屬(Mycena)一類真菌侵染后才能正常發(fā)芽,其后的生長又需要蜜環(huán)菌菌索的侵入提供營養(yǎng)才能繼續(xù)生長完成其生活史。大量研究表明,不同萌發(fā)菌所提供的營養(yǎng)對天麻種子萌發(fā)和種子發(fā)芽后形成的原球莖生長均有較大影響。因此,分離、篩選出優(yōu)良的萌發(fā)菌菌株,對提高天麻種子發(fā)芽率和天麻產(chǎn)量都有十分重要的意義。云南省昭通市是我國公認的天麻道地藥材產(chǎn)地,特別是昭通市彝良縣小草壩所產(chǎn)的天麻,以優(yōu)良的品質(zhì)而馳名中外。昭通市彝良縣小草壩的自然地理環(huán)境狀況和大氣、水源、土壤環(huán)境質(zhì)量均完全符合GAP的要求,適宜于開展天麻GAP種植示范基地建設(shè)。然而昭通產(chǎn)區(qū)至今未見優(yōu)良天麻種子萌發(fā)菌分離成功的報道,因此成功分離培養(yǎng)昭通本地優(yōu)良萌發(fā)菌菌種,對昭通天麻生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。1材料和方法1.1發(fā)芽菌的分離、繁殖和生長特性1.1.1這些材料來自剽竊萌發(fā)菌分離材料采自云南省昭通小草壩,為昭通神農(nóng)公司下屬實驗室在小草壩野生天麻生長區(qū)播種烏天麻種子60d后形成的烏天麻原球莖。1.1.2生長特性觀察參照徐錦堂的方法進行。1.1.3菌落生長特性。取已純化好的擬定萌發(fā)菌菌種接入PDA培養(yǎng)基中,接種量為5mm(直徑)的圓形菌塊,于25℃下分別設(shè)光照、半光照和黑暗3種條件下進行培養(yǎng),定期觀察菌落生長狀況及其生長特性。每處理設(shè)3個重復(fù)。1.2觸發(fā)性室內(nèi)發(fā)芽試驗1.2.1天麻種子萌發(fā)試驗首先制備PDA平面培養(yǎng)基,然后將滅菌后的殼斗科植物葉片平鋪于培養(yǎng)基上,接種經(jīng)分離純化獲得的萌發(fā)菌于培養(yǎng)基上,待葉片上長滿菌絲(15d)后,備用。1.2.2萌發(fā)試驗。剪取一定大小的海綿放入培養(yǎng)皿中,滅菌后倒入無菌水并在海綿上放一張已滅菌的濾紙,然后在無菌操作臺上,于濾紙上放菌葉3～4片,將天麻種子均勻的散播在菌葉上,于25℃下培養(yǎng)并定期觀察記錄。每處理設(shè)3個重復(fù)。1.3天麻種子萌發(fā)菌株和蜜環(huán)菌栽培種野外試驗于2008年6月下旬至7月上旬在云南昭通小草壩神農(nóng)公司試驗地進行。選取室內(nèi)萌發(fā)效果較好的SNm-01菌株為天麻種子萌發(fā)菌,萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌栽培種由神農(nóng)公司下屬實驗室制備,采用烏天麻種子拌萌發(fā)菌套蜜環(huán)菌播種,同時與本地使用的傳統(tǒng)蕨根套蜜環(huán)菌播種法進行比較。60d后(8月下旬)分別挖塘檢查天麻種子的萌發(fā)和生長狀況。每種處理設(shè)5個重復(fù)。2結(jié)果與分析2.1菌落生長和直徑采用天麻原球莖為分離材料(圖1),經(jīng)分離、純化及篩選獲得2株擬定萌發(fā)菌純菌株SNm-01和SNm-02。2株菌具有基本相同的生長特性,在PDA固體培養(yǎng)基中生長時,形成白色均勻絨毛狀菌落,平均生長速度為0.54mm/d和0.32mm/d,培養(yǎng)14d時菌落直徑分別達75.6mm和44.8mm。2株菌菌絲無色透明,具有分隔、分枝和鎖狀聯(lián)合,生長旺盛,菌絲老化后細胞壁厚,都具有氣生菌絲,但SNm-01菌落中菌絲束有規(guī)則地呈螺旋狀彎曲,而SNm-02的氣生菌絲發(fā)達、成束狀,生長速度較快,在光照條件下較黑暗條件下生長良好。2.2子萌發(fā)菌的培養(yǎng)將天麻種子播撒在SNm-01和SNm-02菌株培養(yǎng)的菌葉上,經(jīng)過一定時間后發(fā)現(xiàn)2株菌均能促進天麻種子萌發(fā),為天麻種子萌發(fā)菌。但2株菌促進天麻種子萌發(fā)的時間和效果存在在較大差異,接種SNm-01的菌葉上的天麻種子在保濕培養(yǎng)24d后觀察到種子萌發(fā),48d時可見菌葉上大量天麻種子萌發(fā)形成的原球莖(圖2),而SNm-02則萌發(fā)速度較慢,在播種26d后才觀察到天麻種子的萌發(fā),且萌發(fā)的種子數(shù)較少,培養(yǎng)48d時菌葉上僅見局部區(qū)域內(nèi)有少量天麻原球莖出現(xiàn)(圖3)。2.3原球莖出現(xiàn)的數(shù)量SNm-01菌株野外促天麻種子萌發(fā)及傳統(tǒng)播種天麻種子萌發(fā)結(jié)果見表1。表1結(jié)果顯示,與本地傳統(tǒng)蕨根套蜜環(huán)菌播種法相比,SNm-01野外促天麻種子萌發(fā)效果顯著,5個試驗塘中均有種子萌發(fā),萌發(fā)最多的原球莖達到200個/塘,最少的原球莖也超過50個/塘,空穴率為零且至觀察時大部分原球莖已萌生初生球莖(圖4)。而采用傳統(tǒng)播種法的5個試驗塘中,僅3塘發(fā)現(xiàn)有天麻種子萌發(fā),空穴率達40%,且萌發(fā)的種子數(shù)少(圖5),最多的1塘僅發(fā)現(xiàn)10個原球莖,遠遠低于萌發(fā)菌SNm-01菌株拌播法原球莖出現(xiàn)的數(shù)量。萌發(fā)菌SNm-01菌株不僅能有效促進天麻種子的萌發(fā),對萌發(fā)后原球莖的生長也具有較好的作用,由SNm-01拌播的天麻種子形成的原球莖最大的可達到5×8mm,最小的為2×3mm,明顯大于傳統(tǒng)播種天麻種子形成的原球莖(最大的為2×3mm,最小的為0.8×1mm)(圖6、圖7)。3對天麻種子萌發(fā)菌的種類(1)通過分離獲得兩株昭通本地萌發(fā)菌——SNm-01和SNm-02,生長特性研究和萌發(fā)試驗結(jié)果顯示,2株菌的生長特性基本相同,但菌株SNm-01菌落生長速度較快,室內(nèi)促天麻種子萌發(fā)的效果較好,種子萌發(fā)所需時間短,且萌發(fā)率較高。與傳統(tǒng)的播種方法相比,SNm-01在野外林間大田萌發(fā)實驗中同樣表現(xiàn)優(yōu)良,不僅能有效提高天麻種子萌發(fā)率,對萌發(fā)后原球莖的生長也具有較好的作用,因此SNm-01是一株優(yōu)良的昭通本地萌發(fā)菌。該萌發(fā)菌的獲得對提高昭通天麻產(chǎn)量,促進昭通天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。(2)據(jù)報道目前已經(jīng)鑒定到種的天麻種子萌發(fā)菌均屬于小菇屬(Mycena)真菌,分別為紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、蘭小菇(Mycenaorchidicola)、開唇蘭小菇(Mycenaanoectochila)、石斛小菇(Myc