應(yīng)用lamp法進行胚胎性別鑒定及胚胎移植

應(yīng)用lamp法進行胚胎性別鑒定及胚胎移植

1序言1.1通過推進牛奶性別控制技術(shù)實現(xiàn)奶牛性別控制一直是奶牛生產(chǎn)者的愿望。使奶牛多生母犢,可快速增加良種奶牛數(shù)量的同時,也提高了牛群的質(zhì)量,促進我國奶牛業(yè)向質(zhì)量型方向發(fā)展,這項技術(shù)是目前我國奶牛處于發(fā)展增長時期應(yīng)認真重視的主要技術(shù)途徑。此外,我國目前90%左右的奶牛集中在農(nóng)戶和集體養(yǎng)殖場飼養(yǎng),通過奶牛性別控制實現(xiàn)多生母犢,可明顯提高其經(jīng)濟效益,有利于促進“三農(nóng)”問題的解決,而且可以減少從國外進口奶牛的外匯支出。奶牛性別控制技術(shù)有明顯的經(jīng)濟效益,2003年我國奶牛存欄數(shù)超過800萬頭,按適繁母牛為55%計算,約有440萬頭。繁殖成活率按80%計算,每年約繁殖352萬頭后代,母犢與公犢比例為1∶1,每年增加176萬頭母犢。若采用分離X精子冷凍精液輸精,使產(chǎn)母犢率達到90%～95%,每年將出生316.8～364.4萬頭母犢,比176萬頭增加了149.2～187.6萬頭。若采用改變母牛子宮生理生化環(huán)境的性控技術(shù)方法,試驗結(jié)果已證明雌性胚胎率達70%～75%,每年將出生246～264萬頭母犢,比176萬頭增加70～88萬頭。以每頭母犢4000元計算,每年分別可增加59.68～75.04億元和28～35億元。1.2對精子的性別控制技術(shù):主要有2.目前性別控制技術(shù)主要有以下兩個途徑:(1)胚胎性別鑒定技術(shù):通過超排供體母牛采集到的胚胎,切割取樣后,采用PCR擴增技術(shù),對胚胎性別進行鑒定,性別鑒定的準確率達到95%～100%。由于試劑盒價格較高,對實驗室條件和技術(shù)人員熟練程度要求較高,再加上丟棄一半的胚胎等原因,難于在生產(chǎn)現(xiàn)場條件下大面積推廣應(yīng)用。(2)卵子受精前的性別控制技術(shù):目前主要從以下兩個方面進行試驗研究,a.精子分離法:應(yīng)用流式細胞分離儀分離的X精子冷凍精液進行人工授精,目前已經(jīng)取得了產(chǎn)母犢率達到90%～95%的應(yīng)用試驗結(jié)果。但0.25ml含200萬有效X精子的冷凍精液,銷售價格為400～500元,情期受胎率比普通冷凍精液降低10%左右,每妊娠1頭母牛僅精液成本就需1000～1300元以上,不易在奶牛人工授精生產(chǎn)中進行廣泛推廣應(yīng)用,主要用于生產(chǎn)體外和體內(nèi)性控胚胎,以及良種高產(chǎn)奶牛群的快速擴群。b.改變母牛子宮生理生化環(huán)境法:對發(fā)情母牛于輸精前,將性控藥物注入子宮,使子宮形成有利于X精子,而不利于Y精子的生理生化環(huán)境,達到性別控制的效果。目前已經(jīng)有雌性控制率分別達到55%～69%和70%～75%的不同藥物,但還需要從控制效率和重復(fù)穩(wěn)定性方面進行研究和提高,才能廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)將我們2003年8月～2005年5月開展的不同奶牛性別控制技術(shù)方法的試驗研究情況總結(jié)如下。2材料和方法2.1試驗對象和藥物2.1.1試驗動物2.1.2藥物、試劑和相對生物FSH:中國科學院動物研究所;PG:上海計劃生育研究所;奶牛性控膠囊:北京三牛興業(yè)科技發(fā)展有限責任公司,由4種中草藥提取物配制而成;奶牛性控液:自制,由4種化學藥物配制而成;分離X精子冷凍精液:加拿大愛德現(xiàn)代牛業(yè)發(fā)展集團和內(nèi)蒙賽科星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的X精子冷凍精液;性別鑒定儀和性別鑒定試劑盒:Lamp-100胚胎性別鑒定儀及相應(yīng)試劑盒,日本榮研株式會社生產(chǎn)。2.2測試方法2.2.1肌注、輸精方法(1)超排方法:供體母牛經(jīng)2次PG同期發(fā)情處理,于第2次同期發(fā)情后9～13d開始超排。FSH超排總劑量為8.4～8.8mg(根據(jù)月齡、體重等確定不同劑量),連續(xù)肌注4d,每天早晚各1次,劑量依次遞減,超排第3d早晚各肌注PG1次。(2)輸精方法:發(fā)情后10～12h,輸精1次(1支精液,兩側(cè)子宮角各半只),間隔8～10h;第2次輸精(2支精液,兩側(cè)子宮角各1只);第3次輸精前先檢查卵巢卵泡,若大部分已排卵,則不再輸精;若大部分未排,則再一次輸精(1支精液,兩側(cè)或未排一側(cè)子宮角)。2.2.2輸注運行(1)奶牛性控膠囊:每粒膠囊用2ml生理鹽水溶解后輸入子宮體分叉處,間隔60min后輸精。(2)奶牛性控液:超排前7d和超排開始時分別宮注40ml,發(fā)情后直接用冷凍精液輸精。2.2.3作為樣品的樣品將洗凈的胚胎移入專用切割液中,徒手切取胚胎10%以上的細胞團,作為樣品。采用恒溫循環(huán)基因擴增法,6種引物同時與樣品中的雄性特異核酸系列和雌雄共有的核酸系列進行擴增反應(yīng),然后通過檢測反應(yīng)過程中生成的副產(chǎn)品焦磷酸鎂所形成的白色渾濁物,判斷胚胎的性別。3試驗結(jié)果與分析3.1性別鑒定效果2003年8月～2004年8月,共處理116頭供體母牛,采集到668枚可用胚胎。共鑒定613枚胚胎,將298枚雌性胚胎和12枚雄性胚胎進行移植。由表1可見,對從超排供體母牛采集的613枚胚胎進行性別鑒定,得到的鑒定結(jié)果為:雌性胚胎302枚(49.3%),雄性胚胎311枚(50.7%)。性別鑒定后雌性胚胎的移植成功率為38.0%～43.8%,平均為40.9%(122/298),由此可見在適宜條件下,胚胎在體外培養(yǎng)4～8h,對移植成功率影響不顯著。其中青島地區(qū)由于受體母牛比較分散,移植技術(shù)人員早期經(jīng)驗較少,故移植成功率低于40%。共出生移植后代121頭,其中母犢117頭,準確率為95.9%(117/122),公犢4頭,準確率為100%(4/4),總的性別鑒定準確率為96.0%(121/126)。LAMP胚胎性別鑒定技術(shù)僅需一臺Loopamp終端濁度測定儀,40min即可完成擴增、檢測、判定整個過程,而且性別鑒定準確率達到96%以上,但是需要專門的儀器和試劑盒,較高的實驗室條件,對技術(shù)人員熟練程度要求較高,而且試劑盒價格較高。另外,還要丟棄50%左右的胚胎(雄性胚胎)。胚胎切割后進行冷凍保存,解凍后胚胎的成活率及移植成功率都有一定程度的降低。因此在生產(chǎn)實際中的應(yīng)用推廣面受到一定影響。3.2牛性別控制膠囊的性別控制效果測試3.2.1重復(fù)性實驗結(jié)果由表2可見,二批試驗的雌性胚胎率分別達到70.8%(34/48)和75%(12/16),平均為71.9%(46/64),說明其性控效果的重復(fù)性較穩(wěn)定。3.2.2受精率及精密率由表2可見,14頭供體母牛采集約116枚胚胎中,可用胚胎69枚,受精率87.5%(105/116)。頭均獲4.9枚可用胚胎,與以往未采用性控膠囊的供體母牛頭均獲5～6枚可用胚胎相近,說明應(yīng)用性控膠囊不影響胚胎的受精率和胚胎的可用率。3.2.3明性控膠囊溶液(1)Ⅰ組4ml生理鹽水溶解一粒膠囊,在輸精前1h,每側(cè)子宮角注2ml,14枚胚胎(包括1枚發(fā)育停滯)的性別鑒定結(jié)果雌性胚胎率71.4%(10/14)。Ⅱ組用2毫升生理鹽水溶解一粒膠囊,在輸精前40min注入子宮體分叉處,19枚胚胎(包括5枚發(fā)育停滯胚胎)的性別鑒定結(jié)果,雌性胚胎率52.6%(10/19)。說明性控膠囊溶液應(yīng)有一定的體積,一定的作用時間和作用部位。(2)對供體母牛超排技術(shù)方案進行改進,調(diào)整FSH總劑量,根據(jù)母牛的月齡、體重,區(qū)別用量,且肌注的FSH劑量逐日遞減,頭均可用胚胎數(shù)由4.8～5.3枚提高到6.5～7.0枚。說明超排技術(shù)方案是影響胚胎數(shù)量和質(zhì)量的主要原因。3.3牛奶性別控制的影響試驗3.3.1不同性別控制方法對胚胎性別的影響由表4可見,超排供體母牛在超排前及超排后宮注性控液,可獲得雌性胚胎率達到73.9%(17/23)。說明有較好的胚胎性別控制效果,但性控液使用方法不同,效果不同。超排前7d及超排開始時各加一次性控液,雌性胚胎率為83.3%(5/6);而在超排第3d肌注PG時只加一次性控液,雌性胚胎率為70.6%(12/17),說明加兩次藥比加一次藥的性別控制效果好。奶牛性控液是很有苗頭的性別控制藥物,但由于試驗數(shù)據(jù)較少,還有待于進一步試驗。3.3.2發(fā)育率和胚胎的可用率供體母牛頭均可獲得5.3枚可用胚胎,胚胎受精率為73.3%(33/45),發(fā)育率為48.5%(16/33),胚胎的可用率為35.6%(16/45),說明對胚胎的數(shù)量和質(zhì)量沒有明顯影響。3.4u3000x精子的超排效果(1)表5中加拿大愛德公司的性控精液最后一次試驗中,處理2頭供體母牛,其中一頭采集到0枚胚胎,另一頭采集到15枚胚胎,受精率80%(12/15),發(fā)育率100%(12/12)。由此可見,分離X精子冷凍精液雖然有效精子數(shù)較少,解凍活力較低,但并不影響卵子的受精和胚胎的發(fā)育。(2)由表5可見,每支0.25ml分離X精子冷凍精液,僅含200萬個有效精子,解凍活力為0.2～0.35,但平均受精率為74.8%(86/115),發(fā)育率為76.7%(68/86),胚胎的可用率為5.5枚/頭,冷凍性控胚胎移植后40d未返情率為63.6%(7/11)。這說明已經(jīng)達到供體母牛用常規(guī)冷凍精液輸精的平均超排效果。但超排技術(shù)方案是直接影響超排效果的主要因素。如表5中4頭供體母牛組的超排效果較差,主要是FSH總劑量過高,而且超排方案的遞減劑量安排也不合理,經(jīng)進行調(diào)整后超排效果均明顯提高。(3)在從12頭供體母牛采集到的胚胎中,抽樣61枚胚胎用LAMP胚胎性別鑒定方法進行性別鑒定,得到結(jié)果為雌性胚胎率100%(61/61)。因流式精子分離儀分離速率控制在4500～5000個X精子/s,X精子的分離純度為91%左右,本試驗的性別鑒定胚胎數(shù)量較少,需進一步試驗后才能得出最后的結(jié)論。這幾次試驗結(jié)果證明,應(yīng)用分離X精子冷凍精液進行體內(nèi)性控胚胎的生產(chǎn),已經(jīng)取得良好的超排效果和胚胎性別控制效果,可以大規(guī)模推廣應(yīng)用。4提高男性發(fā)育的性別比例(1)奶牛胚胎性別鑒定技術(shù),性別鑒定準確率達到96.0%(121/126),由于試劑盒價格較高,對實驗室條件以及技術(shù)人員熟練程度的要求較高,再加上損失50%左右的雄性胚胎等原因,在生產(chǎn)實際中的推廣應(yīng)用有一定的限制。(2)改變母牛子宮內(nèi)的生理生化環(huán)境,抑制Y精子的活力,增強X精子授精機率的性別控制藥物,不會降低超排母牛胚胎的數(shù)量和質(zhì)量,雌性率可達70%～80%。另外,由于操作簡便,成本低,比目前人工授精母牛的產(chǎn)母犢率48%提高了22%～32%,可以在生產(chǎn)上