酵母-葡聚糖提取工藝的研究

酵母-葡聚糖提取工藝的研究

1-3-葡萄糖是一種具有活性強、無副作用的高效生物反應(yīng)（brms）。它也是一種低熱量食品原料。它具有腫瘤、增加人體強度和抗菌強度的功能，以及預(yù)防糖尿病、心血管疾病和體重。它已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品[1.4]。酵母細胞壁中含有大量的β-1,3-葡聚糖,我國酵母資源豐富,而且是世界第二大啤酒生產(chǎn)國,每年產(chǎn)生30多萬噸廢啤酒酵母泥,多以低廉的價格作為飼料原料,少量被加工成酵母抽提物,廢啤酒酵母資源未能有效利用。廢棄啤酒酵母自溶后不僅可產(chǎn)生有鮮味的酵母抽提物,而且自溶后的殘渣中多糖含量高、蛋白質(zhì)含量低,如將酵母抽提物與β-1,3-葡聚糖生產(chǎn)進行聯(lián)產(chǎn),回收自溶殘渣中的β-1,3-葡聚糖,就能充分利用資源并獲得高附加值產(chǎn)品。國內(nèi)外曾有人分別采用堿法、酸-堿法、酶-堿法、酶-Sevage法提取酵母β-1,3-葡聚糖,且形成了較成熟的提取工藝,但這些工藝方法酸堿用量大,對環(huán)境污染嚴重,工藝步驟多,所得產(chǎn)品純度不高、得率較低,從而在一定程度上限制了酵母β-葡聚糖的應(yīng)用研究[3,4,7～10]。本研究在比較酸堿法、酶-堿法、自溶法的基礎(chǔ)上,提出了一種新的酵母β-葡聚糖提取方法,即自溶-酶-堿法,該方法不僅堿用量少、得率和純度高,而且實現(xiàn)了酵母抽提物與β-1,3-葡聚糖生產(chǎn)的聯(lián)產(chǎn)1材料和方法1.1酵母粉、葡聚糖啤酒廢酵母泥:武漢市東西湖啤酒廠提供;酵母粉:酵母泥經(jīng)低溫干燥后,粉碎制得;標準β-1,3-葡聚糖:SigmaCo.U.S.A;木瓜蛋白酶:廣州遠天酶制劑廠產(chǎn)品。1.2樣品的制備和分析方法1)酵母β-1,3-葡聚糖的提取。酸堿法(acid-alkalimethod,PT):按文獻的方法進行。酶-堿法(enzyme-alkalimethod,EA):按文獻的方法進行。自溶法(autolysismethod,AE):取一定量經(jīng)預(yù)處理后的酵母,加入2%NaCl溶液,在50℃下自溶24h,自溶結(jié)束后2000r/min離心15min,將沉淀懸浮于3%的NaOH溶液,在75℃下水浴3h,離心去除上清,沉淀經(jīng)蒸餾水水洗3次后進行冷凍干燥,粉碎得成品。自溶-酶-堿法(autolysis-enzyme-alkalimethod,AEA):啤酒廢酵母泥過濾去雜后,離心收集酵母沉淀,所得的酵母加入2%NaCl溶液,于50℃自溶6h后按100U/g濕酵母添加木瓜蛋白酶,繼續(xù)自溶18h后離心,沉淀用2%的NaOH溶液分散,于水浴處理再離心去上清沉淀用蒸餾水清洗3～4遍后進行真空冷凍干燥,粉碎得成品。2)酵母β-1,3-葡聚糖提取物的性質(zhì)分析。溶解性:稱取0.5g提取物數(shù)份,分別加入水、乙醇、乙醚、丙酮、二甲基亞砜、鹽酸、硫酸和3%氫氧化鈉在室溫和加熱的條件下觀察其溶解性。多糖含量:采用苯酚-硫酸法。還原糖含量:采用Somogi-Nelson法測定?？偟?采用微量凱氏定氮法測定。水分含量:采用105℃干燥恒重法測定?；曳?馬福爐揮發(fā)恒重法測定。色度:使用WSC-S測色色差儀直接測定。3)酵母β-1,3-葡聚糖提取物純度的初步鑒定。采用紫外分光光度法分析。將提取物配成DM-SO溶液,采用UV160A型紫外可見光譜儀在200～400nm范圍內(nèi)進行掃描分析。4)分子構(gòu)型分析。采用紅外光譜分析,取微量樣品按1∶6左右的比例與KBr研磨壓片,用NicoletFT-IR紅外光譜儀進行測定,以KBr為參照物。5)酵母β-1,3-葡聚糖提取物的單糖組成分析。采用糖腈乙酰酯衍生物氣相色譜法分析。樣品水解:分別取3種樣品20mg置于安培管中,加入2mL10mol/L硫酸水解30min,加入8mL蒸餾水,封管后置于100℃水解24h,冷卻后加入碳酸鋇中和至中性且無氣體產(chǎn)生,然后離心分離,取上清液過濾,最后將濾液減壓蒸干。衍生化:在水解物中分別加入10mg鹽酸羥胺及1mL無水吡啶,溶解后在90℃反應(yīng)30min,冷卻至室溫,加入1mL無水醋酸酐,在90℃下反應(yīng)30min,冷卻后即可取樣進行氣相色譜分析。色譜條件:OV-1701玻璃毛細管柱(0.32μm×30m),N2為載氣,流速50mL/min,氫火焰離子化檢測器,H20.6kg/cm2,空氣0.5kg/cm2,進樣口溫度250℃,柱溫采用程序升溫,從0min到6.6min為205℃,然后以20℃/min的速率升至230℃。2結(jié)果與分析2.1提取方法的確定1)提取方法對酵母β-1,3-葡聚糖得率及成品組成的影響。按前述酸堿法、酶堿法和自溶法工藝分別提取酵母β-1,3-葡聚糖,并對各成品得率及其多糖、蛋白質(zhì)、水分、灰份含量進行了測定,結(jié)果見表1。從表1可知,3種提取方法中自溶法提取物蛋白質(zhì)含量最低分別為酸堿法和酶堿法的和30%左右,表明自溶法對蛋白質(zhì)的去除最為有效。而在多糖含量上,酸堿法的最高,自溶法次之,酶-堿法最低。水分含量差異明顯,其原因是由于干燥方式不同而造成的,酸堿法采取的是乙醇乙醚脫水法,而酶-堿法和自溶法是采用的真空冷凍干燥法,在得率上,自溶法因操作步驟少,條件較溫和,因而提取物的得率較高。2)不同方法提取的β-1,3-葡聚糖的色度比較。對3種工藝提取物的色度進行了測定,結(jié)果見表2。由表2可知,PT、EA、AE三者顏色均偏黃,但PT略偏紅,而EA、AE略偏綠,且EA比AE更偏綠,在明度上,EA、AE均較PT為好。2.2母-1,3-葡聚糖的檢測在比較酸堿法、酶堿法和自溶法所提取的酵母β-1,3-葡聚糖的得率、色度和組成后,結(jié)合三者優(yōu)點,提出了自溶-酶-堿法提取酵母中β-1,3-葡聚糖的工藝。按自溶-酶-堿法優(yōu)化工藝所得的酵母β-1,3-葡聚糖色澤乳白,無味無臭,其得率10.80%,多糖含量為87.70%、總氮含量為0.07%、水分含量為6.72%、灰分含量為1.05%。1)提取物的溶解性。溶解性觀察結(jié)果表明,酵母β-1,3-葡聚糖不溶于水,乙醇、乙醚和丙酮等有機溶劑,也不溶于鹽酸、硫酸和堿液中,但能在二甲基亞砜中完全溶解并形成穩(wěn)定溶液。2)提取物的單糖組成分析。為檢測酵母β-1,3-葡聚糖的純度,以標準葡萄糖和甘露糖為對照,取成品進行氣相色譜分析,結(jié)果如圖1所示。從氣相色譜分析結(jié)果可知,成品的氣相色譜圖清晰地反映出成品的單糖組分中只有葡萄糖,而沒有其它的單糖組分。這說明提取的成品為均一多糖即葡聚糖。3)成品的紫外光譜分析。成品在200～400nm范圍內(nèi)的紫外掃描分析結(jié)果見圖2。成品在210nm附近有強烈的吸收峰,而260nm和280nm處均無吸收峰。這說明自溶-酶-堿法提取的β-1,3-葡聚糖中不含核酸和蛋白質(zhì)。4)成品的紅外光譜分析。成品與標準甘露聚糖、標準β-1,3-葡聚糖的紅外光譜見圖3。從圖3可看出成品在890cm-1處有明顯的特征吸收峰,表明為β-構(gòu)型,而在810cm-1和870cm-1處均無吸收峰,表明無甘露糖苷的存在;在2920cm-1和1370cm-1處有特征吸收峰,表明產(chǎn)品是具有β-1,3-糖苷鍵的葡聚糖。而1040cm-1和1400cm-1的吸收峰,則是多糖的特征峰。成品的紅外光譜圖及其單糖組成分析結(jié)果都進一步證明了自溶酶堿法提取的酵母葡聚糖的純度較高而且不含其它雜多糖。3不同方法提取的-1,3-葡聚糖的含量、組分、總氮含量在酸堿法、酶堿法和自溶法3種酵母β-1,3-葡聚糖提取工藝中,自溶法對蛋白質(zhì)的去除最為有效,其提取物蛋白質(zhì)含量最低,在多糖含量上,酸堿法的最高,自溶法次之,酶-堿法最低,而采用自溶法時,β-1,3-葡聚糖的得率最高,產(chǎn)物的色澤淺。采用自溶-酶-堿法從廢啤酒酵母泥中提取β-1,3-葡聚糖,得率高達10.80%,其多糖含量為87.70%、總氮含