酒曲的研究進展

酒曲的研究進展

酒曲是通過在制備的谷物及其添加劑上接種或使用天然細菌（細菌、發(fā)酵母菌、細菌）制備的。酒曲是中國酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑,含多種微生物及其產(chǎn)生的酶,其品質(zhì)對酒的產(chǎn)率和品質(zhì)影響極大,故有“曲是酒之骨”之稱。中國是世界三大釀制酒發(fā)源地之一,酒曲發(fā)酵釀酒是中國釀酒的精華所在。根據(jù)風味,中國白酒被分為多種風格,如醬香型、濃香型和清香型等?？v觀世界釀酒史,特別是谷物原料釀酒技術(shù),主要有2大類,一類利用谷物發(fā)芽產(chǎn)生的酶將原料糖化;另一類是用發(fā)霉的谷物制成酒曲,用酒曲中所含的酶將原料糖化。酒曲生產(chǎn)技術(shù)在北魏的《齊民要術(shù)》中第一次得到全面總結(jié),在宋代已達到極高的水平,酒曲品種齊全,工藝技術(shù)完善,尤其是南方的小曲糖化發(fā)酵力很高。商業(yè)釀酒者經(jīng)常根據(jù)當?shù)靥厣虾拖埠蒙a(chǎn)酒曲。因此,酒曲因地域、各家經(jīng)驗而復雜混亂,酒曲質(zhì)量不穩(wěn)定,造成酒質(zhì)量波動顯著,口味各異。另外,酒曲生產(chǎn)沒有統(tǒng)一標準,沒有健全的品質(zhì)檢驗標準等也是導致行業(yè)發(fā)展緩慢的原因。本文討論了酒曲的原料、功效、制備、檢測方法等方面,為酒曲的進一步研究開發(fā)、標準制定等提供參考。1小程序水曲工藝酒曲原料主要是小麥、大米、大麥、豌豆、高粱等谷物,中藥材及特色植物為輔助。中國白酒因其不同風味而大受歡迎,這些風味是因采用的酒曲不同而造成的。如汾酒大曲是清香型大曲,它是利用大麥和豌豆制作而成。張大為等以糯米為基料,甘草、肉桂、陳皮、辣廖草、曲母為輔料制作酒曲?？姇云降纫耘疵缀托←湠橹饕涎兄浦兴幪鹁凭魄?各成分對藥酒曲品質(zhì)的影響依次為甜酒曲>甘草>肉桂>八角茴香;藥酒曲的最佳配比為總重量50g的糯米與小麥4∶1混合、甜酒曲0.20g、肉桂0.015g、甘草0.70g、八角茴香0.03g。越南傳統(tǒng)酒曲因制造者不同,輔料的種類和數(shù)量也不同。然而,最常見的輔料主要是肉豆蔻皮、甘草根、細辛、白豆蔻果、茴香和丁香。茴香和丁香可加強香氣,抑制有害微生物的生長。2影響大曲微生物的因素酒曲發(fā)酵而成大約需1個月,其制作過程已部分工業(yè)化,但主要程序仍保持傳統(tǒng)工藝。傳統(tǒng)大曲制作工藝如圖1。Wang等對茅臺酒大曲制作工藝及其特性形成因素進行了研究,大曲制作過程包括原料混合及定型,發(fā)酵、成熟與干燥3個階段。蒸煮過的谷物、輔料等混合物在一定溫度下發(fā)酵21~28d,6個月的成熟期,成熟階段是微生物生長和風味物質(zhì)生成的最重要時期。大曲主要包括2大部分:原料和多種微生物菌落。大曲特性形成需要復雜微生物菌群,包括真菌(霉菌和酵母菌)和細菌。許多內(nèi)源和外源因素能影響大曲微生物菌落的富集和構(gòu)成,如原料品種、濕度、溫度等。微生態(tài)環(huán)境也可能影響大曲中微生物的變化,其被很多因素限制,如地區(qū)、天氣、水、土壤等。大曲制作過程中微生態(tài)環(huán)境使茅臺酒極其特殊,以致其他地方無法模仿。目前,隨著工藝技術(shù)的提升,制作工藝對酒曲特性影響以及功能性酒曲開發(fā)有了顯著提高。吳岱熹研制富含γ-氨基丁酸的清酒酒曲,將大米浸泡在含有7.5mg/mLVC和2.0mg/mLL-谷氨酸鈉水溶液中過夜蒸熟;然后接種米曲霉3.800;采用變溫培養(yǎng),即30℃20h、32℃4h、35℃14h、38℃8h。以此得到的酒曲中γ-氨基丁酸含量6.936mg/g,清酒中含量0.439mg/mL。Yoshizaki等分析了原料和溫度對紅曲中葡萄糖糖化酶和α-淀粉酶的影響。結(jié)果表明,大麥最適合菌絲生長。在25℃和40℃下可增加酶產(chǎn)量。在紅曲制作后期48h中,溫度從35℃降到25℃,能增加葡萄糖糖化酶和α-淀粉酶產(chǎn)量(分別為25℃時產(chǎn)量的1.4倍和18倍)。淀粉酶和蛋白酶是重要的水解酶,主要用于分解淀粉和蛋白。一個制作精良且貯藏良好的種曲應具有高水解酶活性。酒曲發(fā)酵原料和工藝能影響水解酶產(chǎn)量和活性以及產(chǎn)品的風味。Bechman等發(fā)現(xiàn),發(fā)酵時間和貯藏溫度能顯著影響清酒曲的α-淀粉酶和蛋白酶酶活性、濕度、pH。在對數(shù)生長期,隨著米曲霉數(shù)量的增加,曲中α-淀粉酶活性增加。大麥曲中酶活性顯著高于大米曲,在發(fā)酵46h和58h,酶活性分別達到211.87U和116.57U。當菌種進入穩(wěn)定生長期后,酶活性都相應降低。在發(fā)酵和貯藏過程中,曲中蛋白酶活性相對較低。3葡萄酒中細菌、真菌和酵母菌群落組成微生物是決定酒曲品質(zhì)的核心因素,其隨酒曲種類、產(chǎn)地、部位和工藝的不同而存在差異。在傳統(tǒng)酒曲中存在霉菌、酵母菌和細菌3個主要微生物群。普遍認為,霉菌主要產(chǎn)生淀粉酶,降解淀粉變成可發(fā)酵的糖類;酵母菌把糖轉(zhuǎn)化為酒精;細菌主要是乳酸菌,是最有可能的污染菌。酒曲制作中,發(fā)酵初期霉菌繁殖旺盛,谷物表面長滿菌絲;隨著發(fā)酵的進行,霉菌分解淀粉產(chǎn)生大量糖,為酵母菌的繁殖作好了準備;隨后乙醇不斷積累,破壞了霉菌的生長環(huán)境,霉菌減少,酵母菌占優(yōu)勢。Wang等對茅臺酒曲中200多個菌落進行定性分析,顯示存在細菌、霉菌和酵母菌。細菌由桿狀菌芽孢桿菌為主、乳酸桿菌及醋菌屬和梭菌屬的細菌組成;霉菌由曲霉屬、白霉屬、根霉屬、紅曲霉和木霉屬的霉菌組成,曲霉菌最常見;酵母由酵母屬、漢森酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬和孢圓酵母屬的酵母組成,最常見的為酵母屬。越南湄公河地區(qū)的紫糯米酒是用傳統(tǒng)固體酒曲生產(chǎn)而成。Dung等研究了29個越南商業(yè)酒曲的特性,篩選出6個酒曲,其中總的霉菌、酵母菌和細菌數(shù)分別為3.4~6.0logCFU/g、5.8~7.2logCFU/g和2.6~6.2logCFU/g干重。由119株菌株(53株霉菌、51株酵母菌和15株細菌)組成。活性強的霉菌為淀粉絲菌、非典型淀粉絲菌、少孢根霉和米根霉。淀粉絲菌能產(chǎn)生達25%的葡萄糖,淀粉葡萄糖苷酶活性達0.6U/g。酵母菌中5株為釀酒酵母,它們能使?jié)舛葹?0%的葡萄糖生成8.8%的酒精,批次發(fā)酵中可達13.4%。Fujita等得到植酸酶高產(chǎn)量的米曲霉突變株,突變株產(chǎn)生的植酸酶及相關(guān)酶可從大米植酸中釋放無機磷酸鹽,影響酵母生長。利用這種突變株生產(chǎn)清酒酒曲,可提升醪液中酵母的生長,并且在不影響清酒質(zhì)量的情況下增加酒精產(chǎn)量。對菌種研究較多的為霉菌和酵母菌,對乳酸菌的研究很少。但乳酸菌在發(fā)酵過程中起著很重要的作用。米酒中細菌以乳酸菌為主,其產(chǎn)生的乳酸是米酒酸味的主要來源。乳酸與乙醇反應生成酯類是米酒重要的風味物質(zhì),同時乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生乙醛和雙乙酰,賦予米酒特殊的風味。米酒中乳酸菌可直接應用到實際生產(chǎn)中,有些研究者直接將米酒作為發(fā)酵劑,開發(fā)出不同口味的米酒乳飲料。4抗氧化性化合物酒曲是一種混合微生物發(fā)酵劑,它帶給酒的不僅是酸甜口感、清爽酒香,更寶貴的是其在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物有多種卓越的醫(yī)療輔助作用。早在李時珍的《本草綱目》中就記載了用于釀制小曲白酒的曲藥有藥用功效,常用其治消化不良,根霉酒曲能“消食活血、健脾開胃”。近年來,出于健康安全的考慮,天然抗氧化劑成為趨勢。對于天然抗氧化劑的生產(chǎn),微生物展現(xiàn)出巨大潛力。白曲霉(Aspergilluscandidus)CCRC31543發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物(EAEAC)表現(xiàn)出顯著的抗氧化性。EAEAC中的抗氧化成分被確定為3,300-dihydroxyterphenyllin、3-hydroxyterphenyllin和candidusinB。這些化合物既不會對人體腸道細胞407產(chǎn)生細胞或基因毒性,也不會對沙門氏菌TA98和TA100產(chǎn)生突變。曲霉產(chǎn)生的物質(zhì)如阿魏酸及其衍生物,具有抗癌、抗菌、抗氧化性及血壓調(diào)控等功效。紅曲霉產(chǎn)生多種功效成分,包括紅色素、γ-氨基丁酸和莫納可林K,被應用于著色劑、醫(yī)藥和保健業(yè)。Taniguchi等利用乳酸菌素成功抑制了米酒中火落菌(一種使米酒產(chǎn)生飯腐臭的菌群)的生長,而酒曲中某些菌種能夠產(chǎn)生乳酸菌素,這為通過不同菌群組合產(chǎn)生更多功能甜酒曲的制造提供了可能。在清酒發(fā)酵中,酒曲分泌α-葡萄糖苷酶,催化形成乙基-葡萄糖苷酶,具有護肝和加強角質(zhì)形成細胞的分化功效。在豆醬發(fā)酵過程中,大豆和小麥的過敏原一部分被種曲蛋白水解酶降解,因此豆醬不能誘導大豆有關(guān)的過敏反應。醬油和豆醬的棕色來源于類黑精,它是由還原糖和氨基酸的美拉德反應形成的。類黑精不僅對于食品風味和色澤具有重要作用,而且促進微生物生長,抑制癌細胞生長,抑制消化酶和抑制抗突變性。種曲可作為一種功能性食品或作為其他功能性食品的成分。5其他基因型微生物目前對酒曲研究已經(jīng)進入分子領(lǐng)域,基因組學、蛋白質(zhì)組學逐漸成為研究焦點。傳統(tǒng)微生物定性定量方法有效但耗時費力;分子學方法為微生物分析提供一個新思路。Shi等利用傳統(tǒng)和分子學方法對汾酒曲微生物進行分析,他利用平板法對微生物計數(shù),利用細菌的16SrDNA和真菌的內(nèi)含間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄進行定性,細菌、乳桿菌和放線菌僅在酒曲表面檢測到,芽孢桿菌是主要菌群。復膜孢酵母和伊薩酵母分別是表面和內(nèi)部的主要菌種;此外,在內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了嗜熱真菌。印度研究者利用引物(ITS1-5.8S-ITS2)進行PCR擴增得到5.8SrRNA基因序列,然后對其轉(zhuǎn)錄內(nèi)含間隔區(qū)(即真核生物的內(nèi)含子)進行限制性酶切分析,通過同源比對得到Hamei中酵母菌株分子鑒定結(jié)果,得出9種類型酵母,其中最常見的為釀酒酵母(32.5%)、畢赤酵母(41.7%)和Trichosporonsp.(8%)。Lv等利用巢式PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)對2個發(fā)酵劑(紅曲和藥曲)中微生物(真菌和細菌)進行研究。細菌PCR-DGGE圖譜表明,細菌主要是芽孢桿菌,包括人參土芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。在酒曲中檢測到乳酸菌包括腸膜/赫倫明串珠菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌。真菌PCR-DGGE圖譜表明,藥曲中稻根霉菌、小孢根霉和曲霉屬最常見,在紅曲中為紅曲霉。在一些酒曲中檢測到3個非釀酒酵母(叩囊覆膜酵、季也蒙畢赤酵母和粉狀畢赤酵母)。通過DGGE圖譜計算出的ShannoneWeaver多樣性指數(shù)(H0)和辛普森優(yōu)勢指數(shù)(D)顯示,在紅曲和藥曲中,細菌和真菌的菌落差異顯著。Zheng等利用培養(yǎng)和非培養(yǎng)法(PCR-DGGE)相結(jié)合研究了汾酒大曲的微生物,在很大程度上利用DGGE與培養(yǎng)法得到的菌種重合,但是Weissellacibaria、Weissellaconfusa、腐生性葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、sanfranciscensis乳桿菌、乳酸乳桿菌和巨大芽孢桿菌只能利用DGGE確定。酒曲一般是自然環(huán)境下發(fā)酵,許多病原菌和微小菌參與到酒曲制作中,這對消費者健康具有潛在威脅。PCR-DGGE技術(shù)能評價傳統(tǒng)酒發(fā)酵劑的質(zhì)量,評估傳統(tǒng)的發(fā)酵食品的微生物安全,監(jiān)控潛在腐敗微生物。Chen等利用PCR-DGGE對微生物的16S和18SrRNA基因片段擴增并分析結(jié)果顯示,在制曲過程中,檢測到11株細菌、9株桿菌和7株真菌,其中枯草桿菌和米曲霉是優(yōu)勢菌群。固態(tài)發(fā)酵劑“麥曲”用于中國黃酒發(fā)酵已經(jīng)有數(shù)百年歷史。Zhang等利用蛋白質(zhì)組學分析紹興黃酒麥曲。通過二維電泳得到145個蛋白質(zhì)斑點,接著利用基質(zhì)輔助激光電離解析-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOFMS)定性,確定了10個真菌或細菌分泌的蛋白質(zhì)、43個植物蛋白質(zhì)和1個動物蛋白質(zhì)。制作紹興酒曲的主要菌種為米曲霉菌株SU16,Zhang等對紹興酒曲中米曲霉SU16的分泌物首次進行綜合分析,基于米曲霉基因組序列,利用雙向電泳與MALDI-TOF/TOFMS對分泌物進行蛋白質(zhì)組學分析,在分泌物中確定了41個特異蛋白,其中17個胞外蛋白質(zhì),其余為待定蛋白質(zhì)