加味桃核承氣湯及其拆方對(duì)糖尿病損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中pa和pai-1含量的影響

加味桃核承氣湯及其拆方對(duì)糖尿病損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中pa和pai-1含量的影響

以往的研究表明，加味桃核承氣湯對(duì)糖尿病及其心血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療發(fā)揮了一定的作用。為了探討該處方對(duì)血管病變的影響，我們采用了血清藥理學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)方法。觀察了該處方及其合著者對(duì)人體肚臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（huvec）——在高葡萄糖和高胰島素破壞環(huán)境下，組織類纖維溶酶原激活物（tpa）和plam-1（plam-1）的影響。結(jié)果如上所述。1材料和方法1.1材料分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)取自健康產(chǎn)婦順產(chǎn)新鮮臍帶,無(wú)菌取材,運(yùn)輸液保存,冰袋冷藏取回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行分離,原代培養(yǎng)后傳2～3代用于實(shí)驗(yàn)。1.2內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物羅格列酮由葛蘭素史克(天津)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):04090081);細(xì)胞培養(yǎng)液:基礎(chǔ)培養(yǎng)液M199(LifeGIBCO,美國(guó))加入2.0g/LNaHCO3、0.292g/LL-谷氨酰胺、3.0g/LHepes、10mL/L雙抗液(100倍);完全培養(yǎng)液[不含內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(ECGS)]:M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清(FCS);完全培養(yǎng)液(含ECGS):M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)20%FCS+0.03g/LECGS;造模培養(yǎng)液:M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)20%FCS+0.03g/LECGS+20mmol/L葡萄糖+300mU/L胰島素;ECGS(LifeGIBCO,美國(guó));膠原酶(LifeGIBCO,美國(guó));tPA、PAI-1試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司)。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采用清潔級(jí)SD雄性大鼠,體質(zhì)量180～220g,購(gòu)買并飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):0004897)。基礎(chǔ)鼠料總熱量6.94J/g(質(zhì)量分?jǐn)?shù):蛋白質(zhì)23%、碳水化合物53%、脂肪5%)。1.4藥物處理及-不同濃度標(biāo)準(zhǔn)藥液加味桃核承氣湯(桃仁10g、大黃6g、桂枝6g、甘草3g、芒硝6g、黃芪30g、生地15g、麥冬12g、玄參12g)及其拆方稱量分組為加味方高、中、低劑量組,活血組(桃仁10g、桂枝6g、熟大黃6g),瀉熱通下組(大黃6g、甘草3g、芒硝6g),益氣養(yǎng)陰組(黃芪30g、生地15g、麥冬12g、玄參12g),原方組(桃仁10g、大黃6g、桂枝10g、甘草3g、芒硝6g)。將每組藥物(不含芒硝)用相當(dāng)于藥材量5倍的自來(lái)水浸泡2h,武火煮沸后文火煎煮30min,過(guò)濾后收集煎液,加入芒硝,攪拌充分溶解。原渣再加水煎煮20min,過(guò)濾取煎液。兩液相混合,于水浴恒溫器上濃縮至5g/mL。1.5多次給藥和血樣采集大鼠灌胃藥物為加味桃核承氣湯及其拆方、羅格列酮(4mg);每日灌胃2次(早晚相隔12h),連續(xù)給藥3d。末次灌胃1h后采血(摘眼球法)。血樣靜置3h以上,待血塊收縮良好后,1500r/min離心15min;無(wú)菌吸取上層血清;滅活;加入硫酸汞、疊氮鈉,充分混勻;0.22μm微孔過(guò)濾器濾過(guò)除菌;分裝,-20℃保存。1.6理論等效劑量及實(shí)驗(yàn)結(jié)果取經(jīng)純化及鑒定后的HUVEC分10組:正常組,模型組,羅格列酮(陽(yáng)性對(duì)照)組,加味方高、中、低劑量組,活血組,瀉熱通下組,益氣養(yǎng)陰組,原方組。正常組和模型組均加入空白大鼠血清;加味方中劑量組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量由我們前期實(shí)驗(yàn)成果決定,即大鼠理論等效劑量是人的單位體質(zhì)量劑量的5.75倍。因藥物血清的稀釋度為5,所以單位體質(zhì)量大鼠每次灌胃估計(jì)量為人的單位體質(zhì)量劑量的28.75倍。加味方高、低劑量組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量分別為前者的2倍和1/2倍;各配伍組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量按加味方中等灌胃量計(jì)算而得。1.7細(xì)胞培養(yǎng)板密度選取長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底約80%的HUVEC進(jìn)行傳代,細(xì)胞計(jì)數(shù),以1×104/孔用造模培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔體積200μL,共分9組,每組12孔(測(cè)tPA、PAI-1各6孔),另用普通培養(yǎng)液接種1組12孔(測(cè)tPA、PAI-1各6孔)正常培養(yǎng)細(xì)胞。置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h,添加大鼠血清(空白血清或含藥血清),培養(yǎng)12h,取樣檢測(cè)。1.8-1噸/升采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法原理定量測(cè)定培養(yǎng)液中tPA、PAI-1水平。1.9統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)方差齊者采用隨機(jī)方差分析;數(shù)據(jù)方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。2羅格列酮對(duì)血清tpa、pai-1含量的影響表1結(jié)果顯示,模型組與正常組比較,tPA含量有降低的趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P>0.05);與模型組比較,活血組tPA含量增加(P<0.05),羅格列酮組亦可見(jiàn)這一改變(P<0.01)。模型組較正常組PAI-1含量顯著性升高(P<0.01);與模型組比較,加味方中、高劑量組,活血組,瀉熱通下組,原方組及羅格列酮組PAI-1含量均顯著性降低(P<0.01)。3對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響血管內(nèi)血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)因素與血管內(nèi)皮正常功能密切相關(guān),而tPA和PAI-1對(duì)此起著重要作用。糖尿病(DM)并發(fā)血管病變的機(jī)制極為復(fù)雜,血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的改變是其病理生理改變的重要環(huán)節(jié)。由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的tPA和PAI-1共同調(diào)節(jié)纖溶酶的活性,DM患者tPA/PAI-1平衡失調(diào)提示血管內(nèi)皮功能受損,導(dǎo)致了DM血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組比較,活血組、羅格列酮組可促進(jìn)tPA含量增加,但模型組與正常組比較,tPA含量無(wú)顯著性差異,提示胰島素、葡萄糖可能不是通過(guò)tPA影響血管內(nèi)皮功能,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。另一方面,模型組較正常組PAI-1含量顯著性升高;與模型組比較,加味方中、高劑量組,活血組,瀉熱通下組,原方組及羅格列酮組PAI-1含量均顯著性降低,而且加味方高劑量組、活血組、瀉熱通下組、