黃酒生麥曲中蛋白酶含量的測定

黃酒生麥曲中蛋白酶含量的測定

黃酒的種植是一種影響多種因素的微生物發(fā)酵過程。母乳素是主要的發(fā)芽劑，曲線是主要的糖化劑。曲線中含有多種酶，主要包括液化酶、糖化酶和丙烯酸。這三種酶的大小直接影響糖化和發(fā)酵的效果。曲霉菌中的蛋白質(zhì)分解酶對原料中的蛋白質(zhì)進行水解形成多肽、低肽及氨基酸等含氨化合物,能賦于黃酒特有的風(fēng)味并提供給酵母作為營養(yǎng)物質(zhì)。下面著重來分析一下黃酒生麥曲中的蛋白酶活力。蛋白酶活力的檢測方法一般常用的有二種:一、福林法;二、紫外分光光度法。但制備福林試劑比較麻煩而且有較強的毒性,所以我用紫外分光光度法來測定。紫外分光光度法1材料和方法1.1紫外可見吸收光譜蛋白酶在一定條件下,水解酪蛋白底物,然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng),并使未水解的酪蛋白沉淀除去,濾液對紫外光有吸收(分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后,發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜)。可用紫外分光光度法測定,根據(jù)吸光度計算其酶活力。2酸酸酶緩沖液配制2.10.4mol/L三氯乙酸溶液:稱取65.4g三氯乙酸,用水溶解并稀釋至1000mL。2.21M鹽酸溶液與0.1M鹽酸溶液:量取0.85mL濃鹽酸(比重1.19)用水稀釋至100mL。量取8.5mL濃鹽酸(比重1.19)用水稀釋至100mL。2.3乳酸緩沖液(pH=3.0)適用于酸性蛋白酶甲液稱取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000mL。乙液稱取乳酸鈉(70%)16g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL,加乙液1mL,混勻,稀釋1倍,即成0.05mol/L乳酸緩沖溶液。2.410g/L酪素溶液稱取酪素1.000g,精確至0.001g,用少量濃乳酸2~3滴濕潤后,加入適量的乳酸緩沖液約80mL,在沸水浴中邊加熱邊攪拌,直至完全溶解,冷卻后,轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,用乳酸緩沖液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存,有效期為3天。2.5100μg/mLL-酪氨酸標準溶液3設(shè)備和設(shè)備3.1恒溫水浴(40±0.2)℃。3.2紫外分光光度計。4測量步驟4.1標準曲線的繪制4.1.1標準曲線的繪制吸取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL標準酪氨酸溶液(100μg/mL),分別置于試管中,分別補水10mL、9mL、8mL、7mL、6mL、5mL,稀釋后酪氨酸溶液濃度為0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL,然后,直接用紫外分光光度計在275nm的波長下測定其吸光度(A),以吸光度A為縱坐標,酪氨酸的濃度C為橫坐標,繪制標準曲線(此線應(yīng)通過零點)。根據(jù)作圖,計算出吸光度為1時的酪氨酸的量(μg),即為吸光常數(shù)K值。(其K值應(yīng)在130~135范圍內(nèi))。4.2酶溶液的制備稱10.0g絕干曲試樣,加乳酸緩沖溶液50mL,在30℃浸出1h(每隔15min攪拌1次),用脫脂棉過濾。得到的濾液即為酶液。4.3試樣溶液的吸光度4.3.3計算X=A×K×8/2×1/10×N×E式中X:樣品的酶活力(u/g或u/mL)A:試樣溶液的平均吸光度K:吸光常數(shù)8:反應(yīng)試劑的總體積(mL)2:吸取酶液2.00mL,以1mL計1/10:反應(yīng)時間10min,以1min計N:稀釋倍數(shù)E:紫外法與福林法的換算系數(shù)(酸性蛋白酶系數(shù)為0.77)5結(jié)果與分析根據(jù)作圖與回歸方程Y=λX,求得λ=0.00755,當吸光度A為1時,K值為132.45,這符合要求的范圍。5.2酶溶液中的a值和酶的活性5.2.1僅在不同條件下檢測到過濾紙的數(shù)據(jù)5.2.1.1.采用定量低速過濾紙過濾反應(yīng)溶液的實際吸收值a和酶活性5.2.1.不同濃度微孔濾膜的蛋白酶活力不同的濾紙來過濾測得的A值數(shù)據(jù)來分析,濾紙的孔徑越小相對于空白的A值與酶液的A值也都小些,但蛋白酶活力基本上是差不多的。樣品1用微孔濾膜的蛋白酶活力高。而樣品2卻是用中速一般濾紙的高一些。這我想可能是測定時的誤差造成的。5.2.2不同麥曲線的檢測5.2.2.色麥曲蛋白酶活力從5.2.2.1手工麥曲色澤不同檢測的蛋白酶數(shù)據(jù)來分析灰白色的麥曲蛋白酶活力最高,而黑色麥曲蛋白酶活力最小。白色麥曲蛋白酶活力在中間,從這一點上也符合日常老技工們所說的生麥曲,曲塊呈白色是放潮不夠的表現(xiàn),麥曲塊呈黑色(俗稱爛曲),是水分過多的結(jié)果。這些麥曲都不是好曲?？梢娎锨拜厒儌飨聛淼脑挻_實是正確的,它們符合科學(xué)依據(jù)。這也是實踐出真知的表現(xiàn)。5.2.2.不同加工工藝對麥曲蛋白酶活力的影響從5.2.2.1手工麥曲色澤不同檢測的蛋白酶活力與5.2.2.2三組手工麥曲與機械化麥曲的蛋白酶活力兩表的檢測數(shù)據(jù)中可知,正常的機械化麥曲與正常的手工麥曲相比較,相對而言,手工麥曲的蛋白酶活力稍高一些。這是因為制曲工藝不同造成的。手工曲是靠人力踩的,麥曲的受壓程度肯定比機械化曲小,所以手工曲比機械化曲來得松些,優(yōu)化了菌體生存的空間與條件,這更有利于菌體生長與繁殖。6不同濃度的生麥曲中其總蛋白水平在做多時間差的原因手工生麥曲的蛋白酶活力比機械化生麥曲的蛋白酶活力高,在手工生麥曲中黑色生麥曲與白色生麥曲的蛋白酶活力相對比灰白色的生麥曲蛋白酶活力低。用不同的濾紙來過濾對蛋白酶活力影響是有的,但不是很大。用紫外分光光度法來測量黃酒麥曲中的蛋白酶有著很大的誤差,因為以上的幾個數(shù)據(jù),我是連續(xù)做了好幾次平行試驗才得到的。造成這種誤差的原因是:本身黃酒麥曲中蛋白酶含量不是很高。再加上測定時,紫外分光光度計、水解溫度、反應(yīng)時間、吸量都存在著一定的誤差。記得有一次我只用一只樣做三只平行,而且用微量吸樣器吸樣,溫度基本上是一致的,但在測A值時,三個數(shù)據(jù)中也有一個測定值之差超過3%。這原因我想主要是在反應(yīng)時間上,它們總有點時間差的,而且紫外分光光度計也有點儀器誤差。從這點可知測量生麥曲的蛋白酶活力,它的誤差是相對大的,檢測時一定要十分注意。2.5.1稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精確至0.0002g,用1mol/L鹽酸60mL溶解后定容至100mL,即為1mg/mL酪氨酸標準溶液。2.5.2吸取1mg/mL酪氨酸標準溶液10.00mL,用0.1mo