靈芝多糖測(cè)定方法的比較

靈芝多糖測(cè)定方法的比較

ganocdecmalucidum-靈山糖被認(rèn)為是具有腫瘤、提高身體強(qiáng)度、抗缺氧、消除體內(nèi)自由基、抗輻射、改善肝臟解毒功能、降低血糖和降低血液中的脂質(zhì)。目前市場(chǎng)上靈芝加工產(chǎn)品較多,其質(zhì)量參差不齊,又缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了比較、評(píng)價(jià)以靈芝多糖為有效成分的靈芝原料或靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量,科技工作者研究了苯酚硫酸法,蒽酮硫酸法,3,5-二硝基水楊酸法、Fehling滴定法、碘量法、高效液相色譜法等多種測(cè)定方法。試驗(yàn)對(duì)苯酚硫酸法和經(jīng)過(guò)改進(jìn)的間接碘量法測(cè)定同一樣品靈芝多糖含量的比較研究,旨在為以靈芝多糖為有效成分的靈芝原料和靈芝產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)和技術(shù)儲(chǔ)備。1標(biāo)準(zhǔn)曲線及關(guān)鍵因素法測(cè)定不同多糖含量1.1試驗(yàn)材料①300目靈芝超細(xì)粉,由本室提供。②試劑:葡萄糖,無(wú)水乙醇,苯酚,濃硫酸,碘,碘化鉀,硫代硫酸鈉,無(wú)水碳酸鈉,碳酸氫鈉,重鉻酸鉀,酚酞,淀粉。均為市售分析純商品。③儀器:電子天平,高速離心機(jī),721可見(jiàn)光分光光度計(jì),水浴鍋等。1.2試驗(yàn)方法1.2.1樣品溶液的制備稱取靈芝超細(xì)粉5.0g,加入85%乙醇100mL于60℃水浴保溫30min,3000r/min離心20min,棄上清液,重復(fù)2次以去除單糖,雙糖,低聚糖等干擾性成分。然后加200mL蒸餾水,95℃浸提120min,離心取上清液,定容至250mL,得到樣品溶液:。再?gòu)臉悠啡芤褐腥?0mL,定容至50mL,得到樣品溶液a。1.2.2苯酚硫酸法1.2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取少量分析純葡萄糖,105℃烘箱干燥1h后,置干燥器中冷卻30min。然后精密稱取100mg,用蒸餾水定容至1000mL,得到濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置具塞試管中,各補(bǔ)水至2mL,加入6%的苯酚溶液1.6mL,振蕩.再加入7.5mL濃硫酸,迅速振蕩搖勻,室溫下放置26min。另取蒸餾水2mL,同上操作加苯酚和硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng),做為空白對(duì)照。分別于490nm處測(cè)定以上溶液的吸光度值,以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出回歸方程。1.2.2.2加樣回收率實(shí)驗(yàn)取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL及樣品溶液a0.5mL置于具塞試管中,補(bǔ)水至2mL,按照1.2.2.1測(cè)定吸光度值,重復(fù)測(cè)定5次,代入回歸方程,分別計(jì)算多糖含量,并求出各自的加樣回收率。1.2.2.3精密度及多糖含量測(cè)定取樣品溶液a1.0mL置于具塞試管中,補(bǔ)水至2mL,按照1.2.2.1測(cè)定吸光度值,重復(fù)測(cè)定5次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出多糖含量,并計(jì)算RSD值。其中多糖含量計(jì)算公式為X:樣品中靈芝多糖含量(以C6H12O6計(jì),%;C:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的靈芝多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL)。1.2.2.4重現(xiàn)性測(cè)定另外精密稱取3份靈芝超細(xì)粉5.0g,按1.2.1,1.2.2.1所述方法,分別測(cè)定,測(cè)得靈芝多糖含量,并計(jì)算RSD值。1.3.3間接碘量法1.3.3.1總糖含量的測(cè)定取樣品溶液50mL,用蒸餾水定容至100mL。從中取25mL至具塞錐形瓶中,加酚酞指示劑1～2滴,滴加氫氧化鈉試液至中性,加入稀硫酸25mL,置水浴上回流4h,放冷,滴加氫氧化鈉試液至中性。將上述溶液,加入碘液(0.05mol/L)25mL和飽和碳酸氫鈉溶液10mL,逐滴加入2mol/L氫氧化鈉溶液,邊加邊振蕩,直至試液呈淡黃色,密塞,暗處放置10min,加稀硫酸4mL,立即用0.1mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定,至溶液變?yōu)榈S色時(shí),加淀粉指示液3mL,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失,并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正,即得。重復(fù)測(cè)定3次。每2mL的碘液(0.05mol/L)相當(dāng)于9.008mg的無(wú)水葡萄糖(C6H12O6)。X1:樣品中總糖含量(以C6H12O6計(jì),%);V1:空白溶液消耗硫代硫酸鈉的體積;V2:總糖樣品消耗硫代硫酸鈉的體積。1.3.3.2還原糖含量的測(cè)定取樣品溶液25mL,用蒸餾水定容至100mL。從中取25mL至具塞錐形瓶中,加酚酞指示液1～2滴,滴加氫氧化鈉試液至中性。按照1.2.3.1進(jìn)行滴定,并重復(fù)測(cè)定3次。X2:樣品中總糖含量(以C6H12O6計(jì),%);V1:空白溶液消耗硫代硫酸鈉的體積;V3:總糖樣品消耗硫代硫酸鈉的體積。1.3.3.3靈芝多糖含量的測(cè)定將樣品溶液中的總糖含量減去還原糖含量,即為靈芝多糖的含量。1.3.3.4重現(xiàn)性測(cè)定另外精密稱取3份靈芝超細(xì)粉5.0g,按1.2.1、1和.3.3.1和1.3.3.2所述方法分別測(cè)定,求得靈芝多糖含量,計(jì)算RSD值。2樣品測(cè)定結(jié)果2.1苯酚硫酸法測(cè)定方法的分析2.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立利用excel軟件,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為A=10.537C+0.0288,相關(guān)系數(shù)R2為0.9948,葡萄糖質(zhì)量濃度在0.01～0.07mg/mL符合比爾定律,具有良好的線性關(guān)系。2.1.2加樣回收率測(cè)得5個(gè)樣品吸光度分別為0.563,0.567,0.568,0.570,0.572,計(jì)算出多糖含量分別為50.70μg,51.08μg,51.17μg,51.36μg,51.55μg,理論值為50.00μg,則回收率分別為101.4%,102.2%,102.3%,102.7%,103.1%,平均回收率為102.34%,RSD=0.62%(n=5),回收率良好。2.1.3精密度及靈芝多糖含量的測(cè)定分別測(cè)定五組樣品吸光度值,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,靈芝多糖含量的平均值為2.03%,RSD=2.53%(n=5),精密度良好。2.1.4重現(xiàn)性測(cè)定分別測(cè)定3組樣品,測(cè)得靈芝多糖含量分別為2.01%,2.09%,2.03%,靈芝多糖含量平均值為2.04%,RSD值為2.03%,重現(xiàn)性良好。2.2間接碘量法結(jié)果分析2.2.1總糖和還原糖測(cè)定結(jié)果分別測(cè)定樣品總糖和還原糖含量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3,其中總糖含量平均值為2.07%,還原糖含量為0.79%,靈芝多糖的含量為1.28%。2.2.2重現(xiàn)性測(cè)定分別測(cè)定3組樣品,計(jì)算出總糖含量、還原糖含量、靈芝多糖含量的平均值分別為2.07%、0.79%和1.27%,其RSD值分別為0.74%,0.72%,1.36%(n=3),重現(xiàn)性良好。3間接碘量法與苯酚硫酸法的對(duì)比3.1苯酚硫酸法與間接碘量法測(cè)定靈芝多糖含量,均不需要精密儀器,操作簡(jiǎn)便,穩(wěn)定可靠,總糖含量的測(cè)定結(jié)果也基本一致,分別為2.04%和2.07%。在具體實(shí)驗(yàn)操作中,可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件選擇合適的方法。3.2苯酚硫酸法只能測(cè)定樣品中的總糖量,間接碘量法得出靈芝多糖含量?jī)H為1.27%,樣品中原有還原糖含量為0.80%,可見(jiàn)樣品本身所含還原糖干擾物質(zhì)較多,若將測(cè)得的總糖含量作為靈芝多糖的含量看待,具有較大的誤差;由于靈芝超細(xì)粉多糖的提取液為淡黃色,顯色化合物為橙黃色,比色易受干擾;苯酚容易氧化,見(jiàn)光或遇氧即逐漸氧化成淡紅色,對(duì)顯色也有干擾;苯酚和硫酸的添加量對(duì)顯色也有一定的影響。3.3間接碘量法分別測(cè)定樣品中總糖和還原糖的含量,消除了樣品中還原性雜質(zhì)的干擾,所測(cè)結(jié)果更接近實(shí)際多糖含量。通過(guò)改進(jìn)間接碘量法,使滴定過(guò)程不需在沸騰狀態(tài)下進(jìn)行,從而去除了溫度條件對(duì)滴定結(jié)果的干擾,使反應(yīng)更易控制。間接碘量法具有干擾少準(zhǔn)確度高的特點(diǎn),但與苯酚硫酸法相比,操作過(guò)程較為繁瑣。3.4間接碘量法關(guān)鍵的操作步驟有兩點(diǎn),第一是由于硫代硫酸鈉的不穩(wěn)定性,在使用前必須對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定,否則將給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)較大誤差;第二是在逐滴加入2moI