益生菌的定義與應(yīng)用

益生菌的定義與應(yīng)用

自20世紀(jì)50年代使用抗生素以來(lái)，由于其有害藥物的耐藥性、動(dòng)物體內(nèi)菌群的異質(zhì)結(jié)和抗生素本身的殘留，抗生素已成為世界各國(guó)的主要污染物，并產(chǎn)生了巨大的負(fù)面效應(yīng)，這也是抗生素治療世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素。在這種情況下,益生素(probiotics)的研究和應(yīng)用就引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。隨著微生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)的深入研究,利用益生菌來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的微生態(tài)平衡,恢復(fù)機(jī)體正常生理功能、防治病害、增進(jìn)健康,正逐漸成為世界范圍內(nèi)的熱潮。由于益生菌制品沒(méi)有殘留,也不會(huì)產(chǎn)生抗藥性,許多國(guó)家的飼料和畜禽業(yè)生產(chǎn)者在政府管理部門(mén)限制和禁止使用抗生素的同時(shí),也開(kāi)始主張用益生菌制品來(lái)代替飼料中的抗生素。1益生菌的定義益生菌(probiotics),是微生態(tài)制劑的一個(gè)類別,在國(guó)內(nèi)又譯成益生素、益生劑、生菌素、促生素、生菌劑、益菌劑等。Probiotics一詞源于希臘文,是“共生”的意思,與Antibiotics相對(duì)立,意味著“在動(dòng)物之間的生命維持上起到相互補(bǔ)益的作用”。而它的現(xiàn)代定義則最早在1965年被Lilly和Stillwell闡述為“由一種微生物分泌刺激另一種微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)?！贝撕?隨著對(duì)益生菌研究的深入,益生菌的定義也屢次被修訂。Parker在1974年將其表述為“能促進(jìn)腸道平衡的有機(jī)生命及其相關(guān)物質(zhì)?！彪S后,Fuller在1989年又提出益生菌是“添加于飼料中,通過(guò)改善動(dòng)物腸道微生物平衡而對(duì)其發(fā)揮有利影響的微生物活體”。1994年,在德國(guó)Herborn召開(kāi)的益生菌研討會(huì)上,與會(huì)者又定義益生菌為“益生菌是含活菌和(或)死菌包括組份和產(chǎn)物的微生物制劑,供口服或者經(jīng)由其他粘膜途徑投入,旨在粘膜表面處改善微生物和酶的平衡,或刺激特異性和非特異性免疫機(jī)制”。1997年,Tannock又提出益生菌的新定義“作為飼料添加劑以促進(jìn)動(dòng)物健康的活體微生物”。此外,在國(guó)內(nèi),一些學(xué)者也從不同角度對(duì)益生菌作了修訂和定義。2長(zhǎng)壽研究的理論基礎(chǔ)2.1動(dòng)物微生態(tài)學(xué)微生態(tài)學(xué)即微觀生態(tài)學(xué),是“研究正常微生物群與其宿主間相互關(guān)系的生命科學(xué)分支”。而動(dòng)物微生態(tài)學(xué)則是“研究動(dòng)物體內(nèi)微觀環(huán)境中的正常微生物及其宿主相互關(guān)系的微生態(tài)學(xué)分支”。一般認(rèn)為,動(dòng)物微生態(tài)學(xué)包括4個(gè)方面的內(nèi)容,即動(dòng)物微生態(tài)平衡理論、動(dòng)物微生態(tài)失調(diào)理論、動(dòng)物微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)和動(dòng)物微生態(tài)防治理論。動(dòng)物微生態(tài)理論認(rèn)為,動(dòng)物及體內(nèi)寄生的微生物相互作用,相互影響;在環(huán)境因素的影響下,動(dòng)物與微生物保持動(dòng)態(tài)的平衡;在動(dòng)物與環(huán)境的關(guān)系中,正常微生物群中的原籍菌對(duì)動(dòng)物有益,外籍菌則有害,兩者又可相互轉(zhuǎn)化;正常微生物群的組成存在種屬和個(gè)體的特異性;特定的環(huán)境條件可造成動(dòng)物微生態(tài)失調(diào),使生態(tài)系統(tǒng)喪失功能;動(dòng)物與微生物群之間存在共生關(guān)系,互相提供營(yíng)養(yǎng)等生存條件等。這些理論是當(dāng)前益生菌研究的理論基礎(chǔ)。2.2益生菌的作用機(jī)理益生菌被攝入動(dòng)物體腸道后,在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近400種正常菌群匯合,顯現(xiàn)出棲生、偏生、競(jìng)爭(zhēng)或吞噬等復(fù)雜的關(guān)系,改變生物體內(nèi)的微生物群落,促進(jìn)宿主動(dòng)物的健康。但是,與抗生素相比,益生菌的作用機(jī)理在理論上進(jìn)展還很小,目前主要有3種學(xué)說(shuō):①優(yōu)勢(shì)種群學(xué)說(shuō);②菌群屏障學(xué)說(shuō);③微生物奪氧學(xué)說(shuō)。3益生菌的產(chǎn)生由于逐漸認(rèn)識(shí)到抗生素作為飼料添加劑的種種弊端,因此,世界衛(wèi)生組織(WTO)、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)以及美、日、歐洲各國(guó)均極為重視益生菌的研制,在理論和應(yīng)用方面都進(jìn)行了深入細(xì)致的研究,取得了豐碩的成果。目前,益生菌已在很多國(guó)家進(jìn)入商品化生產(chǎn)。在我國(guó),益生菌研究也得到了蓬勃發(fā)展。但是,國(guó)內(nèi)外目前的益生菌研究,大部分都集中在畜禽業(yè)方面,有相當(dāng)多的資料文獻(xiàn)對(duì)畜禽的益生菌作了深入的報(bào)告。而與畜禽業(yè)相比,水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的研究就少得多,無(wú)論是在數(shù)量還是在研究層次上都與畜禽業(yè)方面的益生菌研究有較大的差距,并且,其真正意義上的商業(yè)產(chǎn)品的實(shí)踐應(yīng)用也只是1986年的事。因此,可以說(shuō),水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的研究尚處于起步階段。4基于水產(chǎn)動(dòng)物的共生基礎(chǔ)研究4.1腸道菌群的變化很顯然,水產(chǎn)動(dòng)物與陸生動(dòng)物的最大不同就在于生活環(huán)境的巨大差異,由此也造成了水產(chǎn)動(dòng)物益生菌與陸生動(dòng)物益生菌的較大差異。不像大多數(shù)陸生動(dòng)物在胚胎階段有羊膜保護(hù),大多數(shù)魚(yú)蝦貝類的幼苗孵化后便直接暴露于水環(huán)境中,立即與水環(huán)境中的微生物發(fā)生關(guān)系,并且在它們的成長(zhǎng)過(guò)程中,消化管一直與外界直接相通,沒(méi)有一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,并遭受著水的沖刷與外界微生物群的直接侵襲,因此,水生動(dòng)物消化道內(nèi)的菌群的更替和定植,與陸生動(dòng)物是很不相同的。另外,水生動(dòng)物體內(nèi)的益生菌群組成與陸生動(dòng)物益生菌組成也不盡相同。在陸生動(dòng)物的消化道中,往往有占優(yōu)勢(shì)的革蘭陽(yáng)性菌存在,而在魚(yú)類貝類消化道中,則往往能發(fā)現(xiàn)大量的革蘭陰性菌。而且,即使是同一菌群,在水生動(dòng)物和陸生動(dòng)物之間也不盡相同。Smith在20世紀(jì)30年代指出,魚(yú)類具有與一般大腸埃希菌不同的魚(yú)類大腸埃希菌,具有液化明膠和不產(chǎn)生吲哚的特性。所以,與陸生動(dòng)物相比,水生動(dòng)物益生菌群在組成、變化甚至選擇難度上都有著自身的特點(diǎn),這也是水生動(dòng)物益生菌研究滯后于陸生動(dòng)物益生菌研究的重要原因。4.2菌的特性特性雖然水生動(dòng)物益生菌在很大程度上與陸生動(dòng)物的益生菌有差異,但是作為益生菌,它們也有一些共同的特征,這些特征是益生菌共有的特征,也是在研究實(shí)踐中鑒定益生菌的很好標(biāo)準(zhǔn)。Fuller在1989年提出,益生菌應(yīng)該具有以下特征:①能為宿主動(dòng)物帶來(lái)有益的影響,如促進(jìn)生長(zhǎng)、抵抗病害等;②應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒無(wú)害的;③在我們不知道其確切作用劑量的條件下,必須在宿主體內(nèi)保持有活力的大量活體;④能在低pH值及有機(jī)酸存在等惡劣的腸道環(huán)境中存在并正常生活;⑤能在儲(chǔ)存保藏條件下較長(zhǎng)時(shí)間地保持穩(wěn)定并維持活力。國(guó)內(nèi)田允波等也提出了作為飼用益生菌的菌種所應(yīng)具有的特征:①無(wú)病原性、無(wú)毒性、無(wú)毒副作用、不與病原微生物產(chǎn)生雜交種;②體內(nèi)外繁殖速度快,具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì);③能在低pH值的無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸及膽酸存在的情況下存活并定植在胃腸道內(nèi);④能產(chǎn)生乳酸、過(guò)氧化氫等腸道致病菌的抑制物;⑤加工后存活率高,混入飼料后室溫下穩(wěn)定性好;⑥能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。4.3水產(chǎn)動(dòng)物益生菌要弄清益生菌的組成是件很不容易的事。在研究較為深入的人類菌群方面,Moore和Holdemann認(rèn)為大概有400種正常腸道微生物。在Fuller的綜述中提到畜禽中常見(jiàn)的益生菌有L.bulgaricus,L.acidophilus,L.casei,L.helveticus,L.lactis,L.salivarius,L.plantarum,Streptococcusthermophilus,Enterococcusfaecium,Ent.faecalis,Bifidobacteriumspp.和E.coli。已確認(rèn)的適合用于生產(chǎn)的益生菌的菌種較少,主要是乳酸桿菌、糞鏈球菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌、仙人山屬菌、優(yōu)桿菌以及酵母菌等。而在水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的研究中,由于水環(huán)境的復(fù)雜性以及水產(chǎn)動(dòng)物菌群的相對(duì)不穩(wěn)定性等原因,對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物益生菌組成的報(bào)道也較為缺乏。Bruno等指出,當(dāng)前水產(chǎn)研究中主要使用的益生菌有弧菌、假單胞桿菌、芽胞桿菌和一些乳酸菌。據(jù)薛恒平等所引杉田治男對(duì)羅非魚(yú)的腸道菌群的研究表明,弧菌和氣單胞菌是羅非魚(yú)腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌,占70%以上,其他還有棒狀桿菌、酵母菌等。薛恒平等同時(shí)還引用Kimiaki對(duì)對(duì)蝦腸道菌群的演替的研究。Kimiaki發(fā)現(xiàn)在對(duì)蝦蚤狀幼年期時(shí),水中的優(yōu)勢(shì)菌(弧菌)同樣也是蝦腸道中的優(yōu)勢(shì)菌。王紅寧報(bào)道鯉魚(yú)腸道中需氧、兼性厭氧優(yōu)勢(shì)菌是氣單胞菌和醇母菌,而厭氧優(yōu)勢(shì)菌是擬桿菌,它們與乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸埃希菌、梭狀芽胞桿菌、假單胞菌一起構(gòu)成腸道內(nèi)正常的菌群。另外,對(duì)于研究最為深入的水產(chǎn)動(dòng)物益生菌之一的乳酸菌,在挪威學(xué)者RingΦ和法國(guó)學(xué)者Gtesoupe的相關(guān)綜述中對(duì)其作了精細(xì)的分類。除此之外,Gatesoupe在1999年的文章中也總結(jié)中了迄今為止大部分已做過(guò)抗菌實(shí)驗(yàn)并得到鑒定的水產(chǎn)動(dòng)物益生菌種。但是,由于水產(chǎn)動(dòng)物益生菌群的復(fù)雜性,因此確切的水產(chǎn)動(dòng)物益生菌譜,至今還無(wú)人報(bào)道。4.4益生菌的市場(chǎng)眾多的研究表明,水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的菌群主要是由魚(yú)吞咽水與進(jìn)食時(shí)所帶入,進(jìn)入體內(nèi)的各種菌種相互作用競(jìng)爭(zhēng),最后達(dá)到生態(tài)平衡,從而形成水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群,起到保護(hù)作用。這種作用可以用圖1表示。Gatesoupe的研究表明,細(xì)菌可以通過(guò)水產(chǎn)動(dòng)物的口腔進(jìn)入體內(nèi),甚至在消化管尚未完全發(fā)育成熟時(shí),第一次攝食活體生物,就可以使Vibrol/Aeromonas菌群在體內(nèi)迅速占據(jù)優(yōu)勢(shì)。田允波等在關(guān)于益生菌的綜述中提到,菌群在腸道內(nèi)定植是通過(guò)細(xì)菌的粘附作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的,乳酸桿菌、雙歧桿菌等進(jìn)入腸道能否粘附于宿主某段腸道粘膜上皮細(xì)胞表面,形成穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)菌群,是決定這種益生菌實(shí)際效果的重要問(wèn)題,而且,益生菌對(duì)宿主的粘附作用還有種屬特異性,細(xì)菌的屬種株不同,其粘附性也有差異。實(shí)際上,菌群在水產(chǎn)動(dòng)物中的定植,從水產(chǎn)動(dòng)物的卵期就已開(kāi)始。Hansen和Olafsen發(fā)現(xiàn),在大西洋鱈與擬庸鰈的卵受精后2小時(shí),在卵上已發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的菌群,其中一部分菌群也是以后動(dòng)物腸道內(nèi)的有益菌群,并且也發(fā)現(xiàn),某些菌群對(duì)于魚(yú)卵的附著存在特異性。Hnansen在1999年的研究中也得出了同樣的結(jié)論。另外,也有研究報(bào)道稱,在孵化4天的大西洋鱈幼魚(yú)和狼魚(yú)魚(yú)苗中發(fā)現(xiàn)已有乳酸菌和C.devergens等益生菌群存在。目前,對(duì)益生菌在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)定植問(wèn)題的研究,一般分為活體實(shí)驗(yàn)和體外研究,這兩方面互相印證,就可以得到較為可信的結(jié)論。Jo¨bornJo¨born等在1997年對(duì)大馬哈魚(yú)的無(wú)毒菌株Carnobacteriumsp分別作了活體和體外的定植實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該菌株在體內(nèi)有穩(wěn)定的定植數(shù)天,在體外則也能成功地在腸粘膜與排瀉物中定植。Vazquez-Juarez等的實(shí)驗(yàn)證明酵母能在虹鱒的腸道粘膜處成功定植。另外,Hansen還研究了正常成熟的益生菌群在海洋冷水性魚(yú)類消化道中建立所需的時(shí)間,他的研究表明,一個(gè)成熟的益生菌群的建立,在第一次進(jìn)食后,要經(jīng)過(guò)幾次更替,需要花費(fèi)數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間才能完成。Gatesoupe在其1999年的綜述中還詳細(xì)列出了在人工控制下各種益生菌在體內(nèi)的最短停留時(shí)間,這是很有價(jià)值的資料(見(jiàn)表1)。除此之外,RingΦ和Gatesoupe他們1998年關(guān)于乳酸菌的綜述中也總結(jié)了關(guān)于益生菌在水生動(dòng)物體內(nèi)定植部位的研究。相關(guān)研究表明,在魚(yú)類整個(gè)消化管,包括從食管到大腸,都有益生菌的存在。但是由于胃中的低pH值環(huán)境、幽門(mén)部膽汁環(huán)境等不適于大多數(shù)益生菌生存,所以在這些部位定植的益生菌很少,而絕大部分益生菌都定植于腸道之中,并且真正起作用的益生菌,大部分也是腸道益生菌群。因此,水生動(dòng)物腸道菌群的情況,可以反映整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡的情況。4.5影響因素4.5.1生活在魚(yú)體內(nèi)的克氏原螯蝦及腸道菌群有很多因素會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)益生菌群的組成、定植與更替。食物無(wú)疑是其中一個(gè)很重要的影響因素。不同種類的食物,甚至食物中不同水平的營(yíng)養(yǎng)素組成,都對(duì)體內(nèi)正常益生菌群產(chǎn)生影響。Syvokienё和Mickёnienё在1995年對(duì)波羅的海沿岸10種海洋魚(yú)類的消化道微生物群作了全年的調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在食性不同的魚(yú)類之間,其腸道微生物群存在很大差異,而在同一種魚(yú)中,不同季節(jié)的腸道微生物群也有很大差異。在夏季,異養(yǎng)型細(xì)菌數(shù)量明顯增多,研究者認(rèn)為,這與夏季有機(jī)生物豐富,魚(yú)所進(jìn)食物有關(guān)。比利時(shí)和中國(guó)學(xué)者在1995年到1996年對(duì)中國(guó)北部的蝦苗調(diào)查也得出了類似的結(jié)論。其他研究也表明,腸道菌群組成因魚(yú)的食性不同而不同,動(dòng)物性食性魚(yú)類主要優(yōu)勢(shì)菌群為腸微球菌、貝內(nèi)克菌群和弧菌,其次是假單胞菌、氣單胞菌,而植物性食性的魚(yú)類還有較多的嗜酸性桿菌和雙歧桿菌。Gatesoupe的研究也表明,當(dāng)把給幼苗的餌料由活性餌料改為配合飼料時(shí),其腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量會(huì)發(fā)生大幅度的下降,但原來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌群卻仍占據(jù)著主要的份額。另外,飼料中某些營(yíng)養(yǎng)素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群也有一定的影響,在這方面,高不飽和脂肪酸(PUFA)對(duì)腸道菌群的影響頗為引人注目。早在20世紀(jì)50年代初期,有學(xué)者指出,少量的PUFA可以促進(jìn)某些微生物的生長(zhǎng),但到了80年代初,又有學(xué)者提出食物中的長(zhǎng)鏈脂肪酸,特別是不飽和脂肪酸,對(duì)于很多細(xì)菌而言是有毒性的。RingΦ于1993年首次研究了亞油酸對(duì)于大西洋紅點(diǎn)鮭腸道微生物群的影響,當(dāng)在飼料中添加2.5%的亞油酸后,腸道中沒(méi)有檢測(cè)到乳酸菌,相反卻觀察到大量的Aermonasspp.Pseudomonasspp.和Enterobacteriaceae。RingΦ認(rèn)為,是飼料中的亞油酸,導(dǎo)致了腸道內(nèi)乳酸菌的衰退。但是,RingΦ在1997年再次進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn),卻得出了相反的結(jié)論。隨后的一些實(shí)驗(yàn)也表明,食物中不同的PUFA含量,確定能引起動(dòng)物腸道菌落的變動(dòng)。雖然機(jī)制仍不明了,但是研究者認(rèn)為,這有可能與食物中PUFA水平改變腸道內(nèi)壁脂肪酸組成有關(guān)。4.5.2溫度和鹽度對(duì)水生動(dòng)物腸道菌群的影響毫無(wú)疑問(wèn),環(huán)境因素,對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群的影響是明顯的。環(huán)境因子包括溫度、鹽度,以及其他生物的影響等等。Kvasnikov等報(bào)道,在塘養(yǎng)魚(yú)類中的乳酸菌密度有隨著季節(jié)變化而變化的特性,其密度最高值是在夏季中期。這表明,氣溫對(duì)于水生動(dòng)物腸道菌群有一定的影響。另外,水的鹽度同樣對(duì)水生動(dòng)物腸道菌群產(chǎn)生影響。有報(bào)道指出,當(dāng)魚(yú)從淡水遷移到海水中時(shí),其腸道菌群會(huì)發(fā)生更替,其中最顯著的是Aeromonas菌群的優(yōu)勢(shì)地位被Vibrio所代替。除此之外,Bergh等在研究初次進(jìn)食對(duì)于擬庸鰈腸道菌群更替的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),初次進(jìn)食后,魚(yú)腸道菌群會(huì)發(fā)生一定的更替,而且,這些更替在環(huán)境中存在浮游植物群落時(shí)進(jìn)行的更快。這說(shuō)明,水環(huán)境中其他生物,尤其是小型生物的存在,對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)菌群會(huì)產(chǎn)生一定影響。4.5.3腸道菌群的穩(wěn)定性當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物遭受到外界對(duì)其產(chǎn)生的不利影響時(shí),比如,食物匱乏、環(huán)境惡化、機(jī)械搬運(yùn)等,即遭受脅迫時(shí),其體內(nèi)的正常菌群同樣會(huì)受到干擾和影響。有報(bào)道稱,當(dāng)食物中某些必需營(yíng)養(yǎng)素缺乏或供給不足時(shí),會(huì)在腸道菌群內(nèi)產(chǎn)生對(duì)該營(yíng)養(yǎng)素的爭(zhēng)奪而導(dǎo)致菌群組成的失調(diào)。也有研究指出,當(dāng)水溫驟變,水環(huán)境惡化,魚(yú)放養(yǎng)密度過(guò)大的情況下,水生動(dòng)物體內(nèi)的微生物群落的微生態(tài)平衡便會(huì)被破壞,由多樣性的微群落結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谀承┚荷L(zhǎng)繁殖而失去微生態(tài)平衡,多種魚(yú)病則可能隨時(shí)發(fā)生。而且,在這種情況下,腸內(nèi)氣單胞桿菌及假單胞菌屬中的一些種類往往會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡?。至于水產(chǎn)動(dòng)物常遇到的搬運(yùn)、人為擾動(dòng)等外界脅迫因子,也應(yīng)該會(huì)對(duì)其微生態(tài)平衡有很大影響,但是很遺憾,目前幾乎沒(méi)有這方面的報(bào)道。4.5.4對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)菌群的影響在水生動(dòng)物體內(nèi)菌群的研究中,人們發(fā)現(xiàn),某些特殊的物質(zhì)會(huì)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群產(chǎn)生意想不到的影響。目前,人們已發(fā)現(xiàn)的這種特殊物質(zhì)主要有鉻、鐵,以及一些特殊的生化物質(zhì)。其中,對(duì)鉻和鐵的研究是人們目前較為感興趣的。作為常用于測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)物消化率指標(biāo)物的氧化鉻(Cr2O3),其對(duì)動(dòng)物體內(nèi)菌群的影響是近年來(lái)才被發(fā)現(xiàn)的。RingΦ在這方面作了大量的工作,他的綜述中指出,在飼料中添加鉻,可以導(dǎo)致腸道與糞便中革蘭陰性菌群的衰落與膽汁?；撬崴饷富钚缘脑黾?。雖然這種情況目前尚未得到很好的解釋,但是RingΦ提出了兩點(diǎn)假說(shuō):①氧化鉻影響消化道壁的吸附性;②需氧菌對(duì)氧化鉻具有高度敏感性。至于鐵對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)菌群的影響,也已有一些研究認(rèn)為,在飼料中限制鐵的含量,會(huì)降低體內(nèi)菌群的數(shù)量。Gatesoupe等研究報(bào)道,當(dāng)用添加了除去鐵鹽的無(wú)機(jī)鹽復(fù)合物的飼料飼喂尖吻鱸幼魚(yú)時(shí),其體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)從109CFU(集落生成單位)/克體重下降為3×108CFU/克體重,可見(jiàn),鐵是水生動(dòng)物維持正常菌群的一個(gè)重要因子。另外,有研究認(rèn)為,影響動(dòng)物腸壁生化組成的糖蛋白、糖脂等也能影響菌群在體內(nèi)的定植與更替。4.6關(guān)于長(zhǎng)壽機(jī)制的研究4.6.1益生菌細(xì)菌素的組成很多在活體與體外條件下所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了益生菌良好的作用效果,但是,就如在本文開(kāi)頭提到的,目前對(duì)于益生菌作用機(jī)理的基礎(chǔ)研究還不是很多,在不少問(wèn)題上也存在著不一致的看法,但是,綜合目前已有的資料來(lái)看,主要集中在幾個(gè)方面。其中,益生菌分泌物的研究是一個(gè)很熱門(mén)的研究方向。很多研究表明,大部分益生菌能夠分泌某些物質(zhì),以抑制或殺死周圍其他異種有害菌群,人們把這些物質(zhì)統(tǒng)稱為細(xì)菌素(bacterocin)。目前,對(duì)細(xì)菌素組份的學(xué)說(shuō)甚多,一般認(rèn)為,他可以是益生菌為與其他菌種競(jìng)爭(zhēng)而釋放的抑菌物質(zhì),也可能是其本身的代謝物質(zhì),抑或二者兼而有之。RingΦ和Gatesoupe認(rèn)為,細(xì)菌素是一種特異性的復(fù)合物,乳酸菌細(xì)菌素的有效成份是過(guò)氧化氫、有機(jī)酸以及它們所分泌的乳酸。這與Lewus等的結(jié)論相似,也與陸上動(dòng)物益生菌細(xì)菌素的研究結(jié)論相仿。但是,其他研究也表明,細(xì)菌素并不都是這些物質(zhì),除此之外還有生物表面活性劑(biosurfactant)、羊毛硫抗生素(lantibiotics)、鐵載體(siderophores),甚至各種短肽,如乳酸鏈球菌肽(Nisin)、肽聚糖(peptidoglycan)等。4.6.2降低病害菌的數(shù)量和密度競(jìng)爭(zhēng)抑制是益生菌的重要作用機(jī)制,也是微生態(tài)理論的主要觀點(diǎn)。在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi),益生菌對(duì)病害菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,大致可分為占位抑制與營(yíng)養(yǎng)抑制。在益生菌所有的生物效應(yīng)中,與病害競(jìng)爭(zhēng)附著點(diǎn),可能是益生菌進(jìn)入體內(nèi)后發(fā)揮的第一個(gè)作用。通過(guò)對(duì)體內(nèi)固定位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng),使益生菌自身在體內(nèi)占到優(yōu)勢(shì),降低病害菌的數(shù)量和密度,起到防病害的作用。在陸生動(dòng)物中的大量研究證明,某些益生菌能夠阻止一些病害菌的定植。在水產(chǎn)動(dòng)物中,對(duì)益害菌雙方定植速度的研究尚不多見(jiàn),多是結(jié)合分泌物質(zhì)的抑菌作用來(lái)探討這個(gè)問(wèn)題。有研究表明,益生菌分泌物功能之一是抑制病害菌的固著能力,從而使自身在競(jìng)爭(zhēng)固著位點(diǎn)時(shí)處于有利地位。然而,競(jìng)爭(zhēng),不僅僅病害菌數(shù)量的減少,在某些情況下,會(huì)出現(xiàn)“自我抑制”(atroinhibition),即在益生菌的有益作用得到保證的前提下,在競(jìng)爭(zhēng)中益生菌本身數(shù)量下降的速度反而要高于病害菌。Gibson等在1998年關(guān)于牡蠣幼體抗病的研究報(bào)告中證實(shí)了這一點(diǎn)。但確切機(jī)理,目前仍不清楚。當(dāng)飼料中營(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)生缺乏時(shí),益害菌之間競(jìng)爭(zhēng)有限營(yíng)養(yǎng)素的利用便也成為相互抑制的重要方面,益生菌通過(guò)更有效地利用有限的營(yíng)養(yǎng)素而導(dǎo)致病原菌營(yíng)養(yǎng)缺乏,并以此使自身在競(jìng)爭(zhēng)中取得勝利,但是遺憾的是,這方面的研究報(bào)道相當(dāng)缺乏。4.6.3益生菌與益生菌群益生菌的作用機(jī)制除了直接的抑菌作用之外,還有其他的作用,那就是對(duì)遠(yuǎn)離消化道的免疫系統(tǒng)的影響。這是益生菌作用機(jī)制中一個(gè)頗令人感興趣的領(lǐng)域,因?yàn)樗崾局嫔c抗生素的重大差異,并成為替代抗生素的一個(gè)重要理由。在陸生動(dòng)物中所進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)表明,動(dòng)物體內(nèi)的益生菌群的存在可以增強(qiáng)動(dòng)物自身的免疫力,其免疫指標(biāo)如巨噬細(xì)胞、免疫球蛋白、抗體等都與益生菌群有著密切的相關(guān)性。但與陸生動(dòng)物相比,水產(chǎn)動(dòng)物這方面的研究則幾乎是一片空白,僅有很少量的文獻(xiàn)報(bào)道了水產(chǎn)動(dòng)物益生菌與其免疫力的關(guān)系。最近,Rengpipat等對(duì)加喂了益生菌株BacillusS11的黑虎蝦的研究表明,益生菌的加喂,明顯提高了蝦的吞噬細(xì)胞的水平,也提高了酚氧化酶與抗菌物質(zhì)的活性,這使得實(shí)驗(yàn)蝦在遭受病原菌的侵襲時(shí),存活率大大高于對(duì)照組的蝦(54.3%:35.5%,P<0.05)。Rengpipat等人認(rèn)為,益生菌除了通過(guò)與腸道病原菌進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)這一途徑之外,也通過(guò)體液和激素的水平增強(qiáng)機(jī)體免疫力來(lái)起到抗病防病的作用。但是,雖然已有研究報(bào)道了益生菌的促免疫作用,然而,應(yīng)當(dāng)承認(rèn)的是,這仍是一個(gè)備受爭(zhēng)議的領(lǐng)域。4.6.4飼料中糖含量對(duì)益生菌抑菌效果的影響除了以上這幾方面的機(jī)制之外,也有一些研究者的研究指出了益生菌可能存在的其他作用機(jī)制。Gatesoupe在其最近的綜述中討論了鐵在益生菌抗病害作用中的地位,Gatesoupe綜合了近幾年來(lái)該方面的研究認(rèn)為,鐵,在益生菌發(fā)揮作用中,是起著一定的輔助功能的。益生菌的抑菌效果,某種程度上受到著鐵載體(siderophore)的調(diào)節(jié)。因此,飼料中鐵的含量可能會(huì)影響到益生菌作用的發(fā)揮。Gram等的研究也得出了類似的結(jié)論。另外,Santos等在體外對(duì)乳酸菌作用的機(jī)理所進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌抗菌的唯一機(jī)理是它產(chǎn)酸后所造成的低pH值環(huán)境使病原菌滅亡,但并未觀察到乳酸菌過(guò)氧化氫以及蛋白水解酶發(fā)揮作用,也未觀察到其與病原菌的營(yíng)養(yǎng)爭(zhēng)奪作用。4.6.5益生菌的營(yíng)養(yǎng)作用就本文所著重論述的范圍而言,益生菌的營(yíng)養(yǎng)作用與定義中所強(qiáng)調(diào)的益生菌生態(tài)方面的意義有一定差異,因?yàn)橐嫔臓I(yíng)養(yǎng)作用并不需要限定菌體的活力程度。但是,益生菌的營(yíng)養(yǎng)作用確實(shí)存在,而且能在生產(chǎn)上產(chǎn)生一定的效果,因此,在談?wù)撘嫔娴淖饔脵C(jī)理,有必要附帶提及益生菌的營(yíng)養(yǎng)作用。水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的益生菌除了本身可以幫助動(dòng)物對(duì)食物進(jìn)行消化,提高飼料的利用效率之外,其本身也往往含有某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如酵母菌、光合細(xì)菌等含有豐富的菌體蛋白和多種維生素等微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可以供給動(dòng)物生長(zhǎng)需要。雖然益生菌的作用更多在于其對(duì)體內(nèi)微生態(tài)的調(diào)節(jié),并改善宿主動(dòng)物的健康狀況,但是,它的營(yíng)養(yǎng)作用,也是值得注意的。4.7分離菌種在水產(chǎn)動(dòng)物益生菌篩選中的應(yīng)用在益生菌的研究中,對(duì)于益生菌的鑒別和篩選,一直是個(gè)制約研究進(jìn)行的重要因素。雖然對(duì)于益生菌的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)已有公論,但是,在實(shí)際操作中,進(jìn)行該項(xiàng)工作實(shí)為不易。目前,對(duì)于益生菌的鑒定,往往通過(guò)采集大量不同菌株,然后在體外進(jìn)行選擇性培養(yǎng)或進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。在這種情況下,研究?jī)?yōu)良的選擇性培養(yǎng)基就顯得格外重要,該方面的研究早已開(kāi)展,并在Gatesoupe的綜述中作了總結(jié)。RingΦ和Gatesoupe在他們關(guān)于乳酸菌的綜述中,也詳細(xì)列出了乳酸菌選擇性培養(yǎng)基的種種原則與方法。Sugita等從7種近海魚(yú)類腸道中分離出1055種菌株進(jìn)行與Vibriovalnificus菌株的抗菌實(shí)驗(yàn),從中選擇出優(yōu)良的益生菌株芽胞桿菌NM12。Riquelme等、Westeroahl等分別在不同的水產(chǎn)動(dòng)物中也進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)。最近幾年來(lái),由于分子生物學(xué)和各種新技術(shù)方法的興起,在水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的鑒別與篩選研究中,也出現(xiàn)了各種新的技術(shù)方法和手段。Vandenbrghe等對(duì)中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖中常見(jiàn)的Vibroharveyi菌株進(jìn)行了全序列的ARLP指紋圖譜分析以獲取確切的遺傳特征。Spanggaurd等同時(shí)采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)篩選法與16SrRNA測(cè)序法對(duì)虹鱒腸道菌群進(jìn)行鑒別,結(jié)果證明兩種方法所得結(jié)果有相當(dāng)?shù)囊恢滦?。Wallner等和Gugenholtz等都在各自的相關(guān)研究報(bào)告中對(duì)分子生物學(xué)在這方面的研究應(yīng)用有詳細(xì)闡述。另外,Berton等建立了以檢測(cè)菌株脂肪酸組成為基礎(chǔ)的自動(dòng)鑒定系統(tǒng),以便更快、更精確地對(duì)目標(biāo)菌群進(jìn)行篩選與鑒定,而相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)和信息網(wǎng)也正在構(gòu)建之中。4.8寡糖和蔗糖對(duì)紅海蝦腸道微生物的影響益生元(prebiotics),是一種能夠促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)。Gibson和Roberfroid定義其為“一種通過(guò)有選擇性的促進(jìn)宿主腸道內(nèi)一定數(shù)量的菌群的生長(zhǎng),提高其活力而達(dá)到增進(jìn)宿主健康的不可消化的食物成份”。目前,在這方面研究最多的是各種寡聚糖(oligosaocharides),如乳果糖、蔗糖寡糖、棉子寡糖等等。有文獻(xiàn)報(bào)道,寡糖的主要生理作用有:①作為動(dòng)物腸道微生物增殖因子;②吸附腸道病原菌,阻斷病原菌在腸道內(nèi)的定植;③作為免疫刺激輔助因子。其中前兩項(xiàng)作用是主要作用。在陸生動(dòng)物中,寡糖作用已得到充分肯定,并有大量研究報(bào)道。在水產(chǎn)動(dòng)物方面,這方面的報(bào)道就少得多,Kihara關(guān)于乳蔗糖對(duì)于紅海鯛腸道微生物的影響作了報(bào)道。初步的研究表明,寡糖類物質(zhì)對(duì)于魚(yú)類等水產(chǎn)動(dòng)物而言,同樣具有扶植益生菌、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用。5水生動(dòng)物和山羊的應(yīng)用研究5.1益生菌在魚(yú)類養(yǎng)殖保鮮中的作用與水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的基礎(chǔ)研究相比,對(duì)益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際效果的研究報(bào)告就相對(duì)較多了。有大量的研究報(bào)道闡述了各種益生菌在各種不同的水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的作用效果。其作效果大致可分為以下幾方面:①抗病害。已有相當(dāng)多的報(bào)道證明益生菌在魚(yú)蝦貝類中可以起到抗病害的作用,提高動(dòng)物在遭受病害侵襲時(shí)的存活率。Gatesoupe在相關(guān)綜述中也列出了已證實(shí)能夠促進(jìn)宿主動(dòng)物抗病害能力的益生菌的目錄(見(jiàn)表2)。②促生長(zhǎng)。也有很多研究表明,在飼料中添加合適的益生菌,可以達(dá)到促進(jìn)魚(yú)蝦貝類的生長(zhǎng)的作用。③提高飼料效率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,有一些對(duì)于魚(yú)類與輪蟲(chóng)的研究表明,飼喂益生菌可以提高魚(yú)的飼料效率與輪蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是,也有極少的研究者對(duì)益生菌的添加效果提出的質(zhì)疑。Gildberg等的研究顯示,在飼料中添加乳酸菌,對(duì)于大西洋大馬哈魚(yú)魚(yú)苗的生長(zhǎng)與存活率并沒(méi)有表現(xiàn)出預(yù)期的效果。5.2益生菌與其它飼成分的協(xié)同作用作為一種活體飼料添加劑,益生菌在實(shí)際使用中的使用條件與飼喂方式跟最后發(fā)揮的效果是有著很密切的關(guān)系的。在這方面,不少學(xué)者作了多方面多種方式的研究,以確定益生菌在實(shí)際應(yīng)用中能發(fā)揮最好的效果。在益生菌的飼喂方式上,Skjermo和Vadstein認(rèn)為在海水幼魚(yú)的養(yǎng)殖中,別人需將益生菌直接投入水中,經(jīng)由益生菌—輪蟲(chóng)—幼魚(yú)的食物鏈即可達(dá)到預(yù)期效果。Rentpipat等實(shí)驗(yàn)了三種益生菌飼喂方式(新鮮活體、正常鹽度的益生菌液以及冷凍干燥的益生菌粉)的投喂效果,結(jié)果表明,在不同狀態(tài)的益生菌制品之間差異無(wú)顯著性。一些研究者也研究了益生菌與其它飼喂成分的協(xié)同作用。Douillet研究比較了飼喂單種益生菌和多種益生菌對(duì)于輪蟲(chóng)的作用效果后認(rèn)為,在輪蟲(chóng)體內(nèi)真正起