基于高壓液相色譜的大道牽引牽引誘導(dǎo)的大道牽引牽引過(guò)敏反應(yīng)鑒定

基于高壓液相色譜的大道牽引牽引誘導(dǎo)的大道牽引牽引過(guò)敏反應(yīng)鑒定

過(guò)敏疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)的三大常因素之一。這是目前世界上的一個(gè)主要衛(wèi)生問(wèn)題。世界上過(guò)敏疾病的發(fā)病率為10%-30%。這種疾病包括過(guò)敏哮喘、過(guò)敏炎癥和食物過(guò)敏。它們是臨床上常見(jiàn)的疾病和多發(fā)性疾病。引起過(guò)敏疾病的主要有兩類。首先，灰塵、花粉、蚊子和動(dòng)物的羽毛。其次，蛋、奶、魚、蝦、貝類和其他食物中的過(guò)敏植物主要是魚類、蝦、貝類和其他過(guò)敏植物，占36%。注冊(cè)輸入是重要的海產(chǎn)食品。臨床上，一些人經(jīng)常食用輸入輸入，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)（如皮疹等），這嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于窒息過(guò)敏的文獻(xiàn)。本文的目的是分離、識(shí)別和提取窒息過(guò)敏，為臨床診斷和科學(xué)研究中的過(guò)敏疾病提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1血清和試劑本實(shí)驗(yàn)所用縊蟶(Sinonovaculaconstricta)購(gòu)于深圳市水產(chǎn)品市場(chǎng),在冰上除去外殼后整體勻漿提取蛋白.過(guò)敏病人的陽(yáng)性血清來(lái)自深圳市人民醫(yī)院和深圳市兒童醫(yī)院.生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體購(gòu)于KPL公司,鏈霉親和素-HRP購(gòu)于Vector公司,其他常用試劑購(gòu)自上海生物工程有限公司.1.2方法1.2.1蛋白質(zhì)提取和sds-表面電泳將樣品在冰浴中勻漿破碎后,用丙酮浸泡放入4℃冰箱中去脂2d,其間冰浴中換丙酮5次,待脫脂的丙酮澄清后倒掉丙酮并在通風(fēng)櫥中風(fēng)干.按每克樣品20mL加入PBS進(jìn)行蛋白提取,每天攪2~4h,一共提取2d.提完后用冷凍離心機(jī)在10000r/min,4℃條件下離心20min,取上清液用PBS液透析(透析帶截流范圍為6~8kD)2d,期間換液5次.透析完后,用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白濃度,并取16μg進(jìn)行SDS電泳,剩余的樣品經(jīng)冷凍干燥后放入-80℃冰箱保存.1.2.2nc膜的提取取含200μg蛋白的縊蟶粗提液進(jìn)行SDS電泳,電泳完取出SDS凝膠,按凝膠的大小剪取NC膜,將膠和膜放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20min后,在35V恒壓下,于4℃冰箱中電轉(zhuǎn)12h.用2%BSA封閉2h后將膜切成11條小帶分別放入血清池中,1~9池中加入9位過(guò)敏病人的陽(yáng)性血清,10池中加入陰性對(duì)照血清,11池加入前面9個(gè)病人的混合血清.搖床上搖2h后將NC膜轉(zhuǎn)入生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體(按1∶1000稀釋)中搖2h.鏈霉親和素HRP按1∶500稀釋后將NC膜放入其中搖2h.最后DAB顯色,待條帶清晰后即用水沖洗終止顯色反應(yīng).1.2.3roin-paktm135a誘導(dǎo)系統(tǒng)鑒定將提取的蛋白經(jīng)HPLC的體積排阻柱純化,柱子為Waters公司的protein-paktm125A預(yù)裝柱.收集各峰后做SDS凝膠電泳,對(duì)比步驟1.2.1、1.2.2的結(jié)果,找出主要過(guò)敏原所在峰,對(duì)該峰用C4反相柱進(jìn)一步純化,純化后的結(jié)果做免疫印跡進(jìn)行鑒定.2結(jié)果2.1總分子量和含量分布縊蟶粗提液蛋白按每孔16μg上樣的SDS結(jié)果如圖1.蛋白條帶有18條,含量高的有6條,分子量分別為110kD、55kD、42kD、38kD、35kD和28kD,其中以35kD處最為富集.35kD以上蛋白多且分布均勻,28kD以下蛋白含量相對(duì)較少.2.2血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果選用臨床上對(duì)縊蟶過(guò)敏患者陽(yáng)性血清(1-9號(hào),11號(hào)為混合血清)以及正常陰性對(duì)照血清(10號(hào))為一抗進(jìn)行免疫印跡(western-blotting),結(jié)果見(jiàn)圖2.除了陰性對(duì)照外,1-9號(hào)均出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶,其中8號(hào)血清出現(xiàn)了4條陽(yáng)性帶,1號(hào)顯示3條陽(yáng)性帶,2號(hào)、4號(hào)和5號(hào)各顯示2條陽(yáng)性帶,3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)只顯示1條陽(yáng)性帶,11號(hào)混合血清則出現(xiàn)5條陽(yáng)性帶.從表1可知,58kD條帶的陽(yáng)性率為100%,38kD條帶的陽(yáng)性率為44%,28kD條帶的陽(yáng)性率為33%,12kD條帶的陽(yáng)性率僅11%.世界衛(wèi)生組織規(guī)定,陽(yáng)性率大于50%為主要過(guò)敏原,所以58kD的蛋白是縊蟶的主要過(guò)敏原,38kD、28kD和12kD蛋白為縊蟶的次要過(guò)敏原.2.3sds-采用最優(yōu)內(nèi)容型蛋白液的構(gòu)建為得到分子量58kD的主要過(guò)敏原,對(duì)縊蟶蛋白進(jìn)行純化.用Waters公司的protein-paktm125A預(yù)裝柱進(jìn)行體積排阻純化,結(jié)果見(jiàn)圖3.一共得到9個(gè)峰,前4個(gè)峰蛋白含量要遠(yuǎn)高于后5個(gè)峰,第1峰蛋白含量最高.收集各峰后做SDS檢測(cè),如圖4.由圖可見(jiàn),經(jīng)SDS鑒定,前4個(gè)峰蛋白含量較高,有清晰的條帶,5-9峰蛋白含量較低,看不出條帶.第1峰蛋白含量最高,條帶也最多,純度不高,2-4峰也都不止一條帶.第4峰中有兩條帶,其中一條與已鑒定的主要過(guò)敏原分子量大小相符,取第4峰蛋白液進(jìn)一步用HPLC反相純化.2.4sds-東南角及western-blct基因信息鑒定圖3中第4峰蛋白經(jīng)HPLC反相純化(如圖5)后得兩個(gè)峰,分別收集峰液做SDS和Western-blotting鑒定(如圖6),發(fā)現(xiàn)第2峰在分子量58kD處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,與預(yù)期結(jié)果相符.因此,第2峰蛋白即縊蟶58kD主要過(guò)敏原蛋白.其它魚類的典型引領(lǐng)物隨著人們生活水平的提高,食物過(guò)敏越來(lái)越受到重視.根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,在美國(guó)約有2%~2.5%的人(600萬(wàn)~700萬(wàn))產(chǎn)生過(guò)食物過(guò)敏,嬰幼兒發(fā)病率約為4%~6%,兒童約為1%~2%,成年人食物過(guò)敏比例比嬰幼兒低,但仍為1%~2%.重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院在一年內(nèi)對(duì)3040名2歲以下兒童進(jìn)行食物過(guò)敏流行病調(diào)查,確診160名兒童產(chǎn)生食物過(guò)敏,發(fā)病率為5.2%,高于美國(guó)發(fā)病率.食物過(guò)敏是世界各地普遍存在的不容忽視的問(wèn)題.海鮮是人們?nèi)粘Ｉ钪凶钪饕鞍踪|(zhì)來(lái)源的食物,也是引起過(guò)敏性反應(yīng)的常見(jiàn)食物.海鮮主要包括魚類(fish)和貝甲類(shellfish).魚類主要的過(guò)敏原為一種12kD左右的熱穩(wěn)定、水溶性、鈣結(jié)合蛋白-小清蛋白(parvalbumin),如鱈魚(cod)的AllergenMGadc1、鮭魚(salmon)的Sals1、鯖魚(mackerel)的Scoj1、Scos1及Scoa1,這種小清蛋白在魚類中存在著交叉反應(yīng).因此,對(duì)某種魚過(guò)敏的病人也可能同時(shí)對(duì)其它魚過(guò)敏.本實(shí)驗(yàn)在8號(hào)病人血清的印跡條帶中發(fā)現(xiàn)了一條12kD左右的過(guò)敏原,分子量大小與魚類的小清蛋白接近,但它不是縊蟶的主要過(guò)敏原.至于它是否為小清蛋白,與魚類是否存在交叉反應(yīng)等,都有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí).貝甲類(shellfish)包括蝦、蟹和軟體動(dòng)物(mollusk),它們的主要過(guò)敏原是一種熱穩(wěn)定的鈣結(jié)合蛋白-原肌球蛋白(tropomyosin),其分子量約40kD左右.本實(shí)驗(yàn)的Western-blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),近一半的縊蟶過(guò)敏患者有分子量為38kD左右的過(guò)敏條帶,故推測(cè)它可能是一種原肌球蛋白.到目前為止,國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有見(jiàn)到對(duì)縊蟶過(guò)敏原的報(bào)道,對(duì)縊蟶的研究主要集中在組織化學(xué)和個(gè)別功能基因的研究.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Wester