植物基因組中的蛋白-蛋白相互作用

植物基因組中的蛋白-蛋白相互作用

2000年12月14日，批準(zhǔn)完成南肖基因的序列計劃的可能性是植物育種的一個重要里程碑。根據(jù)序列比較和共同蛋白基序的鑒定,在125Mbp基因組中鑒定出的25,000個基因中約有70%能夠?qū)ζ溥M(jìn)行功能分類。雖然不能從基因組數(shù)據(jù)庫中推斷出這些蛋白在植物生命循環(huán)中的確切作用,這種分類能使我們首先了解編碼蛋白可能行使的功能。目前面臨的任務(wù)是采用系統(tǒng)的、高通量方法闡明所有“未知”基因的功能?；蚯贸?用微點陣(microarrays)分析轉(zhuǎn)錄本(transcriptome),蛋白質(zhì)組方法和代謝圖譜。雖然這些技術(shù)很有效,但是或是因勞動強度大,或是由于基因間功能冗余,往往得不到足夠的數(shù)據(jù)。系統(tǒng)綜合分析蛋白-蛋白相互作用將為了解蛋白的功能提供重要的信息。研究蛋白-蛋白相互作用的所有遺傳方法中酵母雙雜交是目前較為完善的方法,有許多優(yōu)點:①能用于分析未知的蛋白,因為該方法不需要抗體或純化蛋白;②在酵母體內(nèi)發(fā)生相互作用,而其它方法是依靠體外實驗;③該方法覆蓋了大范圍的相互作用,能檢測出解離常數(shù)(Kd)70nm以上的蛋白間的相互作用。1轉(zhuǎn)錄活性化合物真核生物中有一種特殊的上游激活序列(upstreamactivatingsequenceUAS)?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。它與激活蛋白結(jié)合大大增加啟動子的轉(zhuǎn)錄速度。GAL4蛋白是酵母的轉(zhuǎn)錄活化因子,有兩個結(jié)構(gòu)域(domain),即氨基端的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)以及羧基端的轉(zhuǎn)錄活化域(transcriptionalactivitydomain,AD)。將GAL4蛋白的這兩個結(jié)合域分開時仍具有功能,即BD仍具有DNA結(jié)合功能,但是因缺少AD不能激活轉(zhuǎn)錄;而AD雖有激活轉(zhuǎn)錄,但因無法正確定位于DNA上也不能激活轉(zhuǎn)錄,只有將這兩部分通過適當(dāng)?shù)耐緩竭B在一起后才能恢復(fù)激活轉(zhuǎn)錄的活性。根據(jù)這一特性,Fields等設(shè)計了一個檢測蛋白-蛋白交互作用系統(tǒng)(圖1),即構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒,分別可以表達(dá)GAL4蛋白BD和AD。如果在BD上再接上一個蛋白X,在AD上接上一個蛋白Y,再將這兩個質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌中,這樣,X、Y蛋白在酵母核內(nèi)發(fā)生交互作用,則相當(dāng)與將GAL4的BD和AD又連在一起,可以激活下游GAL1-LacZ基因的表達(dá)。通過測定β-半乳糖苷酶的活性來檢測這種交互作用發(fā)生。常用于雙雜交系統(tǒng)的酵母GAL4的BD和AD;BD的另一個來源是大腸桿菌LexA,另一個來源的AD是病毒的VP16,BD融合到已知蛋白X上(BD-),文庫Y與AD融合(AD-Y)。BD-X和AD-Y通常分別稱為誘餌和獵物。2在植物功能因素研究中，雙混合母株交換法的應(yīng)用2.1與pus3的結(jié)合在大豆中,SyringolidereceptorP34調(diào)節(jié)avrDRpg4基因。但是Syringolide結(jié)合后P34信號傳遞的機理還不清楚。HPR(依賴NADH-羥基丙酮酸還原酶)是參與植物光呼吸系統(tǒng)的一個重要的酶。篩選大豆cDNA文庫,產(chǎn)生兩個具有97%同一性的蛋白P42-1和P42-2。在酵母雙雜交實驗中只有P42-2與P34很好的結(jié)合,表明P42-2,是潛在的第二信使。在光呼吸系統(tǒng)中,使用甘油酸鹽和其類似物,檢驗它們對Syringolide誘導(dǎo)的超敏感反應(yīng)(HR)以評價P42-2的生理重要性。有趣的是HPR的下游產(chǎn)物(甘油酸和3-磷酸甘油酸)抑制了HR,上游化合物(羥基丙酮酸或絲氨酸)對HR沒有明顯影響。表明P42-2是P34/Syringolide復(fù)合物的一個主要靶標(biāo),P42-2與復(fù)合物的結(jié)合通過在黃豆中抑制一個或多個HPR功能也許誘導(dǎo)HR。為了檢驗是否兩個或其中之一P42s結(jié)合P34。將P34融合到LexADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD),與聯(lián)結(jié)到B42酸性激活域(AD)的P42-1或P42-2共表達(dá)。當(dāng)P42-1融合蛋白與P34在EGY48酵母細(xì)胞中共表達(dá)時,僅在它們中間檢測到一絲結(jié)合痕跡,相反P42-2和P34在EGY48酵母細(xì)胞中共表達(dá),β-半乳糖苷酶蛋白高表達(dá)證明結(jié)合很好,僅有P42-2或P34獨自表達(dá)時沒有β-半乳糖苷酶活性,這一結(jié)果證明P42-2/P34結(jié)合的專一性。即使在P42-1和P42-2間觀察到具有97%氨基酸同一性,也僅有P42-2證明與P34具有結(jié)合活性。這表明結(jié)合專一性是由11個或更少氨基酸決定的。P42-2是P34Syringolide受體的第二信使的一個主要成員。2.2個可能的統(tǒng)一大分子用AtPP2CA為誘餌,分離出參與ABA信號的植物蛋白磷酸酶AtPP2CA的一個可能的搭檔蛋白AKT2。最后180個氨基酸缺失的AtPP2CA催化結(jié)構(gòu)域不能發(fā)生雙雜交交互作用,表明這一區(qū)域含有AKT2結(jié)合位點,或AtPP2CA多肽穩(wěn)定與/或適當(dāng)折疊所必需的(Vranovaetal.,2001)2.3關(guān)于基因表達(dá)的分離cDNA文庫,以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑植物中多種環(huán)境和發(fā)育刺激調(diào)節(jié)各種各樣的重疊過程。這些過程包括信號感知、傳導(dǎo)并做出反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明這些相互作用發(fā)生在蛋白復(fù)合物(指信號復(fù)合物)中?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定出信號途徑中對光、生長素、蔗糖和病原體調(diào)節(jié)反應(yīng)的基因,這些基因中大多數(shù)是通過對刺激反應(yīng)的抑制或增強突變體來定義的;其它的分離是由于決定了天然表型變異如對病原體的反應(yīng),這些分離出的基因已被用于信號途徑中的功能“錨定”點。目前的任務(wù)是確認(rèn)結(jié)合到這些“錨定”蛋白上的蛋白以繪制信號復(fù)合物圖,評價相互作用基因的功能。GNOM是一個Gea類型膜相關(guān)功能的ARFGEF,表明其參與了膜運輸。采用酵母雙雜交方法鑒定出了與GNOM相互作用的蛋白親環(huán)蛋白5(Cyp5)。真核生物大ARFGEFs一個獨特的亞家族中保守的相互作用所必須的N-末端對于結(jié)合到Cyp5蛋白上也是必不可少的。Cyp5可能是GNOM作用的潛在調(diào)節(jié)因子。Cyp5是在酵母體內(nèi)與體外專一地結(jié)合到GNOMDNA結(jié)構(gòu)域的一個新蛋白。Cyp5主要在胞質(zhì)中積累但是也與膜發(fā)生聯(lián)系。2.4atsh3p1在生物免疫和免疫中的作用以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。已從基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了一族參與籠形蛋白包被小泡運輸?shù)闹参顰tSH3Ps(ArabidopsisthalianaSH3-containingproteins,擬南芥含SH3的蛋白)。這些蛋白含已預(yù)測的卷曲螺旋域和肉瘤同源物3(Srchomology3)結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域與動物和酵母蛋白相類似,參與了籠形蛋白小泡的形成,分裂和脫殼過程。通過亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級和免疫定位研究證實,AtSH3P1出現(xiàn)在內(nèi)膜系統(tǒng),尤其是定位在或緊鄰在質(zhì)膜及其相關(guān)的小泡,高爾基體成熟面網(wǎng)絡(luò)小泡和部分包被的網(wǎng)狀組織。在這些場所,AtSH3P1都集中在籠形蛋白上。在體外進(jìn)行脂類結(jié)合鑒定法證明,AtSH3P1專一結(jié)合在已知在內(nèi)陷的小窩或內(nèi)吞小泡累積的脂類家族。另外,免疫組織化學(xué)研究和肌動蛋白結(jié)合鑒定法分析表明:AtSH3Ps也調(diào)控沿肌動蛋白細(xì)胞骨架的膜泡運輸。酵母互補研究表明AtSH3Ps與酵母Rvs167p蛋白有相似的功能,參與了胞吞作用和肌動蛋白排列。通過酵母雙雜交篩選、免疫定位和體外結(jié)合鑒定法試驗證明,在AtSH3P1和輔助蛋白類蛋白間有一種新的相互作用。這種相互作用是通過AtSH3P1的SH3區(qū)域和輔助蛋白的富集脯氨酸區(qū)域介導(dǎo)的。輔助蛋白類蛋白通過Hsc70刺激籠形蛋白包被的囊泡脫殼,這一反應(yīng)明顯受AtSH3P1產(chǎn)生所抑制。因此,AtSH3P1在籠形蛋白包被囊泡分裂和脫殼過渡過程中起調(diào)節(jié)或支架作用。2.5生物酶活性化合物的分離和純化用截短的HsfA1做誘餌,從番茄cDNA文庫篩選出了Hsf家族的一個新的成員,HsfA3。HsfA3是一個組成型表達(dá)蛋白。已知在動物細(xì)胞中E2Fs與DP蛋白相互作用,用小麥E2F作誘餌,采用酵母雙雜交篩選已經(jīng)分離出了編碼小麥DP(TmDP)蛋白的cDNA克隆。TmDP普遍表達(dá),并表現(xiàn)出與動物DPs相似的結(jié)構(gòu)域組織。與植物RBR/E2F相互作用中觀察到的專一性相反的是,人和植物的E2Fs和DP蛋白能夠發(fā)生異源相互作用。純化的TmDP蛋白刺激了E2FsDNA復(fù)合物的形成。另外,采用酵母雙雜交方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真核延伸因子1α(LIEF-1α1)的一個同源物在百合中與Ca2+/依賴于鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶(CCaMK)相互作用。2.6酵母雙雜交分析結(jié)果植物中已報道了許多MAP激酶(MAPK),MAPK激酶(MAPKK)MAPKK激酶(MAPKKK)的同源物。雙雜交篩選中用ATMEKK1作誘餌,分離出了一個新的MAPKK同源物,ATMKK2,一個MAPK同源物,ATMPK4和一個未知蛋白。ATMKK2擬南芥中MEK1(MAPKK)有高的序列相似性。根據(jù)酵母雙雜交分析,檢測了ATMEKK1和ATMKK2/MEK1(MAPKKs),ATMKK2/MEK1和ATMPK4(MAPK),ATMPK4和ATMEKK1間蛋白-蛋白間相互作用。ATMKK2/MEK1和ATMPK4(MAPK),ATMPK4和ATMEKK1有兩個明顯的區(qū)域相互作用,分別是N-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和C-末端激酶結(jié)構(gòu)域。ATMEKK1與兩個密切相關(guān)的MAPKKs,ATMKK2/MEK1共表達(dá),增強了后二者的互補酵母pbs2突變體的生長缺陷的能力。ATMPK4和MEK1共表達(dá)補充了mpk1和bck1突變體的生長缺陷。由此表明ATMEKK1,ATMKK2/MEK1和ATMPK4也許組成了一個MAP激酶級聯(lián)。若在雙雜交系統(tǒng)的BD和AD均接上cDNA文庫,讓它們隨機表達(dá)蛋白,這樣檢測報告基因表達(dá)的可能是A-B,B-C等一系列嶄新的蛋白-蛋白相互作用。根據(jù)這些結(jié)果可以繪制出A→B→C的蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜,有利于我們深入研究信號傳導(dǎo)。3缺鐵與nramp1基因的擴增我們從cDNA表達(dá)文庫中篩選出調(diào)節(jié)蛋白的基因—avr9-誘發(fā)子的響應(yīng)蛋白的基因,命名為taMRE-BP。用taMRE-BPcDNA作探針篩選小金海棠cDNA文庫,得到了MxMyb1基因。通過差示篩選法獲得fdr3(基因登錄號:AF262623)。從小麥cDNA文庫中篩選出3-磷酸甘油酸脫氫酶(基因登錄號:AF261227),該基因缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)。采用DDRT-PCR與Northern結(jié)合,得到3個缺鐵誘導(dǎo)有差異的cDNA克隆片段(減弱表達(dá))為:ATP-BindingTransporter,cytC合成相關(guān)的基因,D-dTP-葡萄糖脫水酶基因。通過RT-PCR方法,從小麥中獲得Nramp1基因,用RACE法從小金海棠cDNA文庫中克隆出了Fe(Ⅱ)—轉(zhuǎn)運蛋白基因MxIrt1(登陸號:AY193886)。采用RT-PCR,從低鐵脅迫山定子中擴增出了Mb.Nramp1基因(基因登錄號:AY724413)。通過對缺鐵和EDTA螯合二價鐵誘導(dǎo)5天的水稻根實驗,并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的微點陣(microarray)分析。在10531個水稻cDNA芯片圖譜中,發(fā)現(xiàn)了