細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

近年來，微生物基因組的科學(xué)研究取得了迅速進(jìn)展。根據(jù)美國基因組研究所（tigr）的報(bào)告，縮短了241種微生物的研究序列，并開展了9種微生物的研究。這些基因組信息揭示了大量的未知功能的開放讀碼框,因此探尋一種研究這些基因功能的有效方法和確定其編碼產(chǎn)物在行使其生物學(xué)功能過程中相互作用便成為了功能基因組學(xué)(Functionalgenomics)的主要課題。早在10多年前,ChienCT便成功地將一種用于體內(nèi)研究的遺傳學(xué)方法應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用,進(jìn)而開發(fā)出了一種用于體內(nèi)研究蛋白質(zhì)之間相互作用的酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2HS)。隨后該技術(shù)得到了不斷的完善、擴(kuò)展和多樣化,并在篩選與特定蛋白相互作用的靶蛋白、已知蛋白之間的相互作用結(jié)構(gòu)域作圖以及基因組范圍的蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)譜的描繪等方面得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交系統(tǒng)的成功極大地刺激了與其類似方法的發(fā)展。1998年DoveSL和HochschildA在E.coli中成功地建立了細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)(Bacterialtwo-hybridsystem,B2HS),從而極大地豐富了蛋白質(zhì)相互作用的研究手段。本文主要從細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的原理與分類,在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行綜述。1細(xì)菌雙交系統(tǒng)的原理和分類1.1根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)1.1.1ranp的基因序列分析,即“引導(dǎo)”與“靶”的相互融合,并激活“靶”與“化合物1-3-基-5-羥基-4-甲基-5-靶-5-羥基-4-ranp的相互作用,激活報(bào)告基因,激活報(bào)告基因,激活報(bào)告基因,激活報(bào)告基因,激活報(bào)告基因,激活報(bào)告基因,激活ranp的轉(zhuǎn)錄在E.coli中,如果相互作用的蛋白一個(gè)通過DNA結(jié)合域與DNA結(jié)合,另外一個(gè)與細(xì)菌RNAP的亞單位結(jié)合,那么只要其相互作用具有足夠的強(qiáng)度便能夠激活轉(zhuǎn)錄。因此,如果把“誘餌(Bait)”與序列特異性的DNA結(jié)合蛋白融合,而把“靶(prey)”與細(xì)菌RNAP的一個(gè)亞單位融合,那么“誘餌”與“靶”的相互作用便可以在啟動(dòng)子處征募RANP并穩(wěn)固其結(jié)合,激活報(bào)告基因(Reportergene)的轉(zhuǎn)錄(圖1)。在該系統(tǒng)中,DNA結(jié)合蛋白通常為λ噬菌體抑制劑(λcI),而RANP亞單位一般為α,報(bào)告基因可以是編碼β內(nèi)酰氨酶的bla和β半乳糖苷酶lacZ基因,也可以是參與組氨酸生物合成途徑的HIS3基因和鏈霉素抗性基因aadA,但是后者具有篩選更大文庫的能力(~108以上)和更低的假陽性率(~3×10-8)。1.1.2toxr蛋白的激活和激活霍亂弧菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控劑ToxR蛋白是一種整合膜蛋白,由位于胞漿的N末端DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,DBD)、一次跨膜片段(TM)以及周漿C末端域組成。在異源宿主E.coli中ToxR蛋白能以二聚體依賴的方式激活位于ctx操縱子的基因轉(zhuǎn)錄,并且這種依賴只取決于DBD,DBD的wHTH基序?yàn)槠浣Y(jié)合DNA和激活轉(zhuǎn)錄的最低需要。當(dāng)用異源蛋白組件或者TM片段取代ToxR的周漿域和TM片段時(shí),可用于在周漿中研究蛋白質(zhì)的相互作用(圖2A)以及在自然膜環(huán)境下TM片段之間的相互作用;當(dāng)使用缺乏TM片段的ToxR蛋白變體時(shí),ToxR蛋白也可以用于在胞漿區(qū)室中蛋白質(zhì)之間相互作用的研究(圖2B)。嵌合蛋白之間的相互作用可以激活與ctx啟動(dòng)子融合的報(bào)告基因(如:lacZ和catZ基因)。1.2通過轉(zhuǎn)讓限制和細(xì)菌混合系統(tǒng)1.2.1i的低二聚化轉(zhuǎn)錄抑制劑λ噬菌體抑制劑(λcI)是一種控制λ噬菌體溶菌/溶原周期轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄抑制劑。當(dāng)與λ操縱子結(jié)合時(shí),λcI可阻止參與溶菌程序的基因表達(dá),并且可以使λDNA整合入E.coli染色體使λ噬菌體進(jìn)入溶原周期。λcI是由一條236個(gè)氨基酸組成的多肽鏈二聚化而成。每條鏈包括結(jié)合DNA的N末端域(DBD)和決定二聚化的C末端域(DD)。λcI只有在二聚化的形式下才能作為一種轉(zhuǎn)錄抑制劑,缺乏二聚化能力的DBD不能單獨(dú)抑制轉(zhuǎn)錄,然而當(dāng)其分別與可以相互作用的多肽或者蛋白質(zhì)融合時(shí)(圖3),便可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。因此,多肽或者蛋白質(zhì)的相互作用可以通過與λ啟動(dòng)子-操縱子融合的報(bào)告基因表達(dá)的抑制或者細(xì)菌對(duì)噬菌體的敏感性而得到檢測。但是該系統(tǒng)有很明顯的缺點(diǎn):①DBD本身具有低二聚化的能力,可單獨(dú)顯示組成性的低轉(zhuǎn)錄抑制活性;②該系統(tǒng)不能用于篩選具有二聚化能力的“靶”蛋白,也不適合篩選cDNA文庫,因而限制了該系統(tǒng)的應(yīng)用。1.2.2lexa雜交系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成和特點(diǎn)LexA是一種在E.coli中控制SOS基因轉(zhuǎn)錄的抑制劑。與λcI類似,LexA也是由結(jié)合DNA的N末端域(DBD)和決定二聚化的C末端域(DD)組成(圖5),也只能以二聚化的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。但是LexA雜交系統(tǒng)與λcI雜交系統(tǒng)相比其優(yōu)勢在于LexADBD無內(nèi)在的二聚化能力和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄抑制活性。因此該系統(tǒng)即便在“誘餌”或者“靶”易于二聚化的情況下也可以用于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。1.3鼠二氫葉酸還原酶許多酶片段可以潛在地劈成兩個(gè)互補(bǔ)片段,并在一定條件下,重新關(guān)聯(lián)恢復(fù)其內(nèi)在的酶活性。在分子克隆中廣泛應(yīng)用的α互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)便是基于酶的這一特性而設(shè)計(jì)。類似地,如果酶的兩個(gè)片段在單獨(dú)表達(dá)時(shí)不能自發(fā)地重新關(guān)聯(lián),而只有在分別與相互作用的蛋白質(zhì)或者多肽融合時(shí)才能夠相互關(guān)聯(lián)并恢復(fù)其酶活性,并且這種酶活性在體內(nèi)能夠比較容易地檢測或者篩選,那么該酶便可以用于雙雜交系統(tǒng)。鼠二氫葉酸還原酶(Mousedihydrofolatedeductase,mDHFR)便是一種這樣的酶。該酶可被劈成兩個(gè)片段F1和F2(圖4),它們不能自發(fā)地重建酶的活性,除非分別與相互作用的蛋白質(zhì)或者多肽融合。表達(dá)功能性重新組裝的mDHFR的細(xì)菌能很容易地篩選,在細(xì)菌而非真核生物的DHFR抑制劑甲氧芐錠的選擇性抑制下,mDHFR的活性為E.coli生長所必須,因此通過細(xì)菌生長或者使用甲氨蝶呤的熒光素結(jié)合物的熒光法而很容易地檢測到mDHFR片段的關(guān)聯(lián)。1.4ac基因缺失導(dǎo)致的細(xì)菌煤質(zhì)腺苷酸環(huán)化酶(Adenylatecyclase,AC)是百日咳桿菌主要的毒力因子,由1706個(gè)氨基酸組成。它能侵入真核細(xì)胞,被鈣調(diào)蛋白激活后可催化ATP產(chǎn)生超生理水平的cAMP。cAMP是真核細(xì)胞的一個(gè)很關(guān)鍵的第二信使分子,也是細(xì)菌尤其是E.coli基因表達(dá)的多效調(diào)控劑?；诖?近年來,AC作為一種信號(hào)酶而被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌雙雜交篩選。AC的催化域由兩個(gè)互補(bǔ)片段T25(氨基酸殘基1~224)和T18(氨基酸殘基225~399)組成(圖5),并且這兩個(gè)片段為酶的活性所必須。當(dāng)T25和T18作為獨(dú)立的實(shí)體在內(nèi)源性AC缺陷的E.coli中共表達(dá)時(shí),不能互相識(shí)別和重建酶的活性;然而,當(dāng)分別與可發(fā)生相互作用的多肽或者蛋白質(zhì)融合時(shí),嵌合蛋白的二聚化便可以導(dǎo)致AC片段功能性的互補(bǔ)以及cAMP的生成。cAMP與分解代謝激活蛋白(Cataboliteactivatorprotein,CAP)結(jié)合,便可以激活分解代謝操縱子,從而允許細(xì)菌發(fā)酵碳水化合物,比如麥芽糖(Maltose)和半乳糖(Lactose)。因此多肽或者蛋白質(zhì)的相互作用便可以通過指示培養(yǎng)基(比如MacConkey/maltose或者LB/X-gal)或者選擇性培養(yǎng)基(麥芽糖和半乳糖作為唯一碳源)而得到檢測。2細(xì)菌雙交系統(tǒng)對(duì)致病性微生物的影響2.1生物致病機(jī)制細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)是一種研究基因產(chǎn)物生物學(xué)功能和闡明病原微生物致病機(jī)制的有效工具。下面主要對(duì)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)在病原微生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、毒力因子的分泌和毒力因子與宿主蛋白相互作用的分子機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)行簡要介紹。2.1.1系統(tǒng)發(fā)育中的檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signaltransduction)是細(xì)胞信號(hào)的跨膜傳遞,在病原微生物適應(yīng)外界環(huán)境以維持其正常的新陳代謝中起重要作用。在百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis),三元三羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Tripartitetricarboxylatetransporters,TTT)參與了檸檬酸鹽的攝取,該轉(zhuǎn)運(yùn)體由一個(gè)周質(zhì)檸檬酸鹽結(jié)合蛋白BctC以及兩個(gè)整合膜蛋白BcrtB和BctA組成。位于bctCBA操縱子前面的是bctDE操縱子,編碼兩元件系統(tǒng)BctDE。研究表明,在無檸檬酸鹽的環(huán)境中,只有少量的BctCBA轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生,相反在檸檬酸鹽的環(huán)境中,負(fù)荷有檸檬酸的BctC可以誘導(dǎo)大量的BctCBA轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生,并且BctC與BctDE均為檸檬酸鹽誘導(dǎo)BctCBA轉(zhuǎn)運(yùn)體上調(diào)所必須。當(dāng)BctC存在而轉(zhuǎn)運(yùn)體的膜元件BctB和BctA缺乏時(shí),bctCBA表達(dá)水平急劇升高?；贏C級(jí)聯(lián)通路重建的細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí),負(fù)荷有檸檬酸的BctC可以與傳感轉(zhuǎn)導(dǎo)體BctE的周漿域直接結(jié)合。因此推測,負(fù)荷有檸檬酸的BctC和BctE周漿域的結(jié)合激活了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)事件,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體操縱子的上調(diào),從而最大化利用環(huán)境中的檸檬酸鹽。在E.coli,Fe3+-檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因fecABCDE的轉(zhuǎn)錄由始于細(xì)胞表面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來調(diào)控。Fe3+-檸檬酸鹽與外膜蛋白FecA的結(jié)合可引發(fā)一個(gè)信號(hào),該信號(hào)由FecR從細(xì)胞漿膜傳遞到細(xì)胞漿,并在細(xì)胞漿激活σ因子FecI,隨后活化的FecI便可通過指導(dǎo)RANP核心酶與fecABCDE基因啟動(dòng)子的結(jié)合而激活該基因的轉(zhuǎn)錄。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)FecA可與FecR相互作用,而FecR可與FecI相互作用。用基于LexA抑制劑的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)對(duì)其相互作用域作圖顯示,N末端FecA1–79片段能夠與C末端FecR237–317相互作用,N末端FecR1–85能與FecI1–173相互作用。雙元件系統(tǒng)代表了病原微生物的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,因此利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件之間的相互作用進(jìn)行研究有利于更好地理解它們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,同時(shí)為設(shè)計(jì)新的藥物以破壞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件之間的相互作用提供理論依據(jù)。2.1.2轉(zhuǎn)錄激活劑基因檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA的相互作用是基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)。在鮑特菌屬(Bordetella),伴侶開關(guān)正向同源物(Partnerswitcherorthologs)參與第三型分泌(Typesecretion,TTS)的調(diào)控。鮑特菌的第三型分泌系統(tǒng)(Typesecretionsystem,TTSS)由bsc基因座位編碼。鮑特菌TTSS的調(diào)控基因座位包括四個(gè)基因btrS、btrU、btrW和btrV,分別編碼BtrS、BtrU、BtrW和BtrV四種蛋白。BtrS是σ因子的正向同源物,可以激活TTS裝置元件和分泌因子編碼基因以及btrU、btrW和btrV的轉(zhuǎn)錄?？功乙蜃拥恼蛲次顱trW可以與BtrS結(jié)合并阻止其與RNAP的接觸而抑制BtrS的轉(zhuǎn)錄活性?；谡髂糝NAP的細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,抗抗σ因子的正向同源物BtrV可以與BtrW相互作用從而解除BtrW對(duì)BtrS的抑制作用,并且保守的絲氨酸殘基BtrVS55為其相互作用所必須。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的一個(gè)重要的毒力決定子是第三型分泌系統(tǒng)TTSS,它可以把細(xì)菌效應(yīng)蛋白(毒素)直接轉(zhuǎn)位入真核細(xì)胞內(nèi),從而逃避局部免疫應(yīng)答、破壞上皮細(xì)胞和抑制傷口的愈合。已知ExsA是TTSS基因轉(zhuǎn)錄激活劑,而ExsD是ExsA的抑制劑,在環(huán)境分泌信號(hào)缺乏時(shí)ExsD結(jié)合ExsA而抑制轉(zhuǎn)錄。但是基于LexA轉(zhuǎn)錄抑制的雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,在低Ca2+條件下,伴侶蛋白ExsC可與ExsD結(jié)合,釋放出ExsA,而激活TTSS基因轉(zhuǎn)錄。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的型菌毛在細(xì)菌粘附宿主細(xì)胞中起關(guān)鍵作用,其表達(dá)部分地由FimZ、FimY、FimW和FimU調(diào)控?；贚exA轉(zhuǎn)錄抑制的細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,FimW對(duì)菌毛表達(dá)的抑制不是通過直接與DNA作用,而是通過與結(jié)合DNA的激活蛋白FimZ的相互作用。沙門氏菌致病島1(SalmonellaIpathogenicityisland1,SPI1)介導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌血清型Enterica穿入腸粘膜細(xì)胞。SPI1的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄激活劑HilA調(diào)控,但是其具體調(diào)控機(jī)制未知。已知hilD基因能夠正調(diào)控hilA基因的表達(dá)而hilE基因能夠負(fù)調(diào)控hilA基因表達(dá)。LexA細(xì)菌雙雜交試驗(yàn)顯示,HilE蛋白可以與HilD相互作用。因此HilE蛋白可能通過與HilD的結(jié)合中和轉(zhuǎn)錄激活作用,從而實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄抑制功能?；虮磉_(dá)調(diào)控既是病原菌適應(yīng)外界環(huán)境的需要,同時(shí)也是吸附、侵襲和感染宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)。因此,用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)去探索基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)深刻理解病原菌的致病機(jī)制以及尋求抗微生物藥物具有重要意義。2.1.3關(guān)于效應(yīng)蛋白的活性許多細(xì)菌的毒力因子(Virulencefactor)定位于細(xì)菌的表面或者由細(xì)菌分泌,已知的毒力因子分泌途徑可以分為“分泌系統(tǒng)Ⅰ~Ⅳ”四大類。TTSS存在于許多革蘭陰性病原菌,介導(dǎo)一系列的效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞漿。效應(yīng)蛋白通過對(duì)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的調(diào)控為病原菌生存服務(wù)。但是對(duì)效應(yīng)蛋白的分泌機(jī)制仍了解不多。目前認(rèn)為許多效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位需要一個(gè)同質(zhì)的伴侶蛋白。伴侶蛋白通常與其N末端結(jié)合,阻止效應(yīng)蛋白在分泌前的過早關(guān)聯(lián)以及降解。鼠傷寒沙門氏菌血清型Enterica的SigD蛋白由TTSS分泌并為細(xì)菌有效侵入上皮細(xì)胞所必須。雖然編碼SigD和SigE的基因均位于sigDE操縱子,但是SigE蛋白確切功能未知。通過基于AC級(jí)聯(lián)反應(yīng)重建的細(xì)菌雙雜交試驗(yàn),Darwin等發(fā)現(xiàn)SigE是TTS的伴侶蛋白,并能夠二聚化以及直接與SigD蛋白相互作用。對(duì)參與TTS途徑蛋白質(zhì)之間相互作用的識(shí)別,有利于探討效應(yīng)蛋白分泌和注入宿主細(xì)胞的分子機(jī)制。2.1.4cta1的激活細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)可用于識(shí)別和鑒定毒力因子和宿主蛋白之間的相互作用。識(shí)別和鑒定這些相互作用是理解病原微生物感染和致病機(jī)制的關(guān)鍵?；魜y毒素(Choleratoxin,CT)是霍亂弧菌(V.cholerae)的主要致病物質(zhì),具有潛在的腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性,由一個(gè)CTA亞單位和五個(gè)相同的CTB亞單位組成。CTA亞單位的水解產(chǎn)生了CTA1和CTA2。CTA1包含酶活性位點(diǎn),CTA2在CTA1和CTB之間起橋梁作用,CTB可與小腸粘膜上皮細(xì)胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合,介導(dǎo)CTA1進(jìn)入細(xì)胞。在體外,CTA1的活性可通過與真核蛋白腺苷二磷酸核糖基化因子(ADP-ribosylationfactor,ARF)的相互作用激活?；贏C信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)重建的細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,CTA1可與人ARF發(fā)生直接的相互作用,此外,通過氨基酸的取代產(chǎn)生的CTA1突變體與AFR相互作用的能力顯著降低。ARF與CTA1的結(jié)合可能一方面促進(jìn)了CTA1與NAD的結(jié)合,另一方面降低了CTA1酶的Km和Vmax值。激活的CTA1可使NAD上的腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移到G蛋白,稱GS。GS的活化可使細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高,主動(dòng)分泌Na+、K+、HCO3-和水,導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐。雖然目前關(guān)于細(xì)菌雙雜交在尋求病原微生物作用的靶或者細(xì)胞配體(Partners)方面的資料較少,但是,無疑細(xì)菌雙雜交技術(shù)為病原微生物基因產(chǎn)物與細(xì)胞蛋白的相互作用及病原微生物致病機(jī)理等研究開辟了廣闊天地。2.2細(xì)菌雙雜交技術(shù)在原核生物蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用隨著病原微生物基因組研究的不斷深入,以及后基因組紀(jì)元(Post-genomicera)的到來,注釋和預(yù)測蛋白質(zhì)的功能已經(jīng)成為后基因組紀(jì)元最具挑戰(zhàn)性的問題之一。作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的基本元件,蛋白質(zhì)之間的相互作用是蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵性的決定子。因此在基因組范圍內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用圖譜進(jìn)行描繪的蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)(Interactomics)在蛋白質(zhì)功能研究中具有重要意義。近年來,用酵母雙雜交技術(shù)已成功地對(duì)E.coli噬菌體T7、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)以及幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)等的蛋白質(zhì)相互作用圖譜進(jìn)行描繪。這些相互作用圖譜將有助于在系統(tǒng)水平理解發(fā)育和疾病發(fā)生的機(jī)制、闡明單個(gè)蛋白的功能和相互作用組(Interactome)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)、以及為如何把蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的生化特征整合入生物系統(tǒng)提供理論依據(jù),同時(shí)也為預(yù)測蛋白質(zhì)(基因)功能提供有用的資料。雖然細(xì)菌雙雜交技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用圖譜描繪還未見報(bào)道,但是作為一種更加高通量篩選和操作更為簡便的方法,可以預(yù)見將在病原微生物尤其是在原核生物蛋白質(zhì)相互作用圖譜描繪中發(fā)揮更大的作用。但雙雜交技術(shù)都必需與蛋白質(zhì)微列陣(Proteinmicroassays)、質(zhì)譜(Massspectrometry)和生物信息學(xué)等方法結(jié)合才能為蛋白質(zhì)相互作用圖譜的描繪提供高置信度的資料。2.3細(xì)胞內(nèi)抗體的篩選科研工作者已經(jīng)在基因工程和藥物開發(fā)等方面用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了大量的探索和嘗試,同樣,基于“誘餌”與“靶”的結(jié)合來篩選“靶”分子的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)在基因工程和藥物的開發(fā)中很可能也扮演重要角色。這些包括:①從噬菌體展示抗體庫或者實(shí)體(Aptamer)中篩選出與靶抗原肽結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)抗體(Intrabody)——單鏈抗體片段(Singlechainantibodyfragments,scFv)和細(xì)胞內(nèi)二抗(Introdiabody)。在細(xì)胞液的還原性環(huán)境中,細(xì)胞內(nèi)抗體由于存在穩(wěn)定性、溶解性和聚集傾向等方面的問題,并不是所有的細(xì)胞內(nèi)抗體都能與它們的靶抗原結(jié)合,因此有必要從其中篩選出與靶抗原肽結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)抗體。細(xì)胞內(nèi)抗體在對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原實(shí)施蛋白質(zhì)敲除(Proteinknockout)策略領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。近年來,細(xì)胞內(nèi)抗體已成功地應(yīng)用于病原微生物蛋白