飲用水中內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的分析評(píng)價(jià)

飲用水中內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的分析評(píng)價(jià)

美國(guó)環(huán)境管理局（idc）對(duì)內(nèi)部干預(yù)藥物的定義是：它是一個(gè)外源性物質(zhì)，可以改變身體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并對(duì)身體的、后代或亞組產(chǎn)生副作用。它通常存在于各種環(huán)境條件中，通過(guò)各種方式進(jìn)入人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)身體的內(nèi)部導(dǎo)管系統(tǒng)，尤其是生殖系統(tǒng)產(chǎn)生重大影響。如果你用gl-1或gl-1進(jìn)行，或更低的濃度。目前，通過(guò)色度技術(shù)進(jìn)行了各種測(cè)試和研究。由于檢測(cè)技術(shù)的局限性，很難確定非常低的eds。這些物質(zhì)不會(huì)對(duì)人體或其他生物產(chǎn)生任何影響。根據(jù)研究，即使sdi-1的單獨(dú)成分濃度較低，并且檢測(cè)費(fèi)用也低于l-1。即使它們的幾種共生形式同時(shí)存在，它們也會(huì)影響正常的室內(nèi)生殖器類(lèi)的代謝和繁殖機(jī)制。因此，為了全面評(píng)估飲用水中edc對(duì)人體健康的影響，有必要分析和評(píng)估水源和飲用水中的內(nèi)部干擾效應(yīng)，了解sdc對(duì)水源和飲用水中的污染，以及不同傳統(tǒng)處理方法和配水管網(wǎng)對(duì)內(nèi)部干擾效應(yīng)的影響。本研究以松花江哈爾濱段上、中、下游江水,以及以松花江為水源的哈爾濱市某自來(lái)水廠進(jìn)廠原水、各處理工藝單元出水及管網(wǎng)末端飲用水為對(duì)象,利用固相萃取/酵母雙雜交法,調(diào)查了以上各水體的雌激素活性,分析了傳統(tǒng)凈水工藝對(duì)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的去除情況,以期為保護(hù)人體健康及相關(guān)政策法規(guī)的制定提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù).1材料和方法1.1試劑和儀器雌二醇(17β-Estradiol,E2)、二甲基亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO)和鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)購(gòu)自Sigma公司,無(wú)氨基酸酵母氮堿(yeastnitrogenbasewithoutaminoacids)購(gòu)自Difco公司,DO/-Leu/-His添加劑購(gòu)自Clontech公司.HPLC級(jí)甲醇購(gòu)自Dikma公司,色譜純級(jí)二氯甲烷購(gòu)自天津科密歐公司,超純水為Milli-Q純水儀制得,18.2MΩ·cm-1.其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2水樣預(yù)處理及固相萃取處理sem于2006年與2007年的夏季與秋季(7～10月),每個(gè)季度2次,以哈爾濱市為中心在松花江沿線自上而下同時(shí)采集了4處水樣,分別為上游四方臺(tái)水源地水A、中段水B(公路大橋上游約200m處)、中段水C(東濱鐵路橋上游約500m處)及下游水D(污水廠下游約2000m處).于2007年4、5、6及9月,每月1次,同時(shí)采集了哈爾濱市某自來(lái)水廠進(jìn)廠原水、混凝沉淀后出水(沉后水)、砂濾后出水(濾后水)、氯消毒后出廠水(出廠水)及用戶管網(wǎng)末端自來(lái)水(管網(wǎng)水).除此外,還于2006年9、10月及2007年1月又分3次采集了管網(wǎng)水.水樣預(yù)處理采用國(guó)際上最常用的固相萃取法.為了防止水中的懸浮顆粒在固相萃取過(guò)程中堵塞填料,其中的目標(biāo)物分兩部分分別進(jìn)行富集與測(cè)定:水樣取回實(shí)驗(yàn)室后立即過(guò)1μm玻璃纖維濾膜(Whatman),對(duì)濾過(guò)液用濃硫酸調(diào)pH<2后固相萃取富集,對(duì)膜上截留的顆粒物質(zhì)采取凍干處理.實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及玻璃纖維濾膜全部預(yù)先500℃灼燒2h.實(shí)驗(yàn)選用WatersC18固相萃取小柱,于水樣濃縮前依次用5mL甲醇與5mLMilli-Q水活化小柱,富集時(shí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)(SupelcoVisiprepTMDL十二管防交叉污染固相萃取裝置)真空度使水樣過(guò)柱流速大約控制在10mL·min-1.洗脫時(shí)用甲醇/二氯甲烷(80/20,體積比)混合洗脫液共10mL分2次洗脫柱子.2次洗脫液合并后,輕柔氮?dú)獯蹈?最后用DMSO定容.各水樣富集濃縮6000～8000倍.將已凍干截留有顆粒物質(zhì)的玻璃纖維膜,剪成約為5mm×5mm的小塊,加一定量的甲醇/二氯甲烷混合萃取劑隔夜浸泡,再超聲波輔助萃取3次,每次5～10min.萃取液氮?dú)獯蹈珊驞MSO定容.考慮到實(shí)驗(yàn)所用溶劑及樣品濃縮富集過(guò)程中有空白來(lái)源,所以對(duì)3份1000mL超純水做相同處理步驟作為試劑空白,結(jié)果均呈陰性反應(yīng).上述兩部分測(cè)定結(jié)果之和為水樣總雌激素活性.1.3誘導(dǎo)活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因酵母菌由中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心提供.該酵母菌是人工構(gòu)建的一種能夠同時(shí)表達(dá)人雌激素受體基因和受體共激活因子GRIP1基因的雙雜交酵母.測(cè)試方法見(jiàn)文獻(xiàn),本研究中稍加改進(jìn).將菌種接種至SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基中,在30℃、130r/min條件下培養(yǎng).當(dāng)菌懸液生長(zhǎng)至600nm處吸光度值(D600)為2～6時(shí),用同一培養(yǎng)基稀釋菌懸液至D600值為0.75左右,移取稀釋后的菌懸液0.995mL于1.5mL離心管中,加入5μL待分析樣品,混合均勻.每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)濃度梯度,每個(gè)梯度做4個(gè)平行測(cè)試.然后從離心管中移取200μL樣品至96孔板中,于30℃、800r/min條件下振蕩培養(yǎng)4h.培養(yǎng)結(jié)束,首先測(cè)定菌懸液的D600值,然后每孔棄去150μL菌液,再分別加入120μL測(cè)試緩沖液[21.51gNa2HPO4·12H2O、6.22gNaH2PO4·2H2O、0.75gKCl及0.25gMgSO4·7H2O溶解并定容于1L蒸餾水中(基礎(chǔ)緩沖液),再向配好的基礎(chǔ)緩沖液中加入3.33mL十二烷基磺酸鈉溶液(0.1%)和270μLβ-巰基乙醇]和20μL氯仿,在30℃、1050r/min條件下培養(yǎng)10min,然后向每孔分別加入40μLONPG(13.3mmol·L-1,溶于基礎(chǔ)緩沖液中),在30℃、800r/min條件下培養(yǎng)進(jìn)行顯色反應(yīng).顯色結(jié)束后,每孔加入100μLNa2CO3溶液(1mol·L-1),在30℃、600r/min下再培養(yǎng)10min以終止顯色反應(yīng).分別從每孔移取上清液200μL至新96孔板中,測(cè)取420nm處吸光度值(D420).同時(shí),以5μLDMSO作陰性(空白)對(duì)照,以5μL溶有E2的DMSO作陽(yáng)性對(duì)照,按上述方法進(jìn)行測(cè)定.用下式表示β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)活性U:U=D420?D′420t×V×D600U=D420-D′420t×V×D600式中,t為加入ONPG到溶液顯色時(shí)的反應(yīng)時(shí)間,min;V為菌液體積,mL;D600、D420分別為菌懸液在600、420nm處的吸光度值;D′420是空白對(duì)照在420nm處的吸光度值.以DMSO為溶劑,配制一系列濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法測(cè)定U值,得出E2的劑量-活性效應(yīng)關(guān)系曲線.計(jì)算得出該法的EC50值為5.95×10-11mol·L-1,即16.184ng·L-1.根據(jù)實(shí)際水樣測(cè)得的U值,將其雌激素活性換算成E2當(dāng)量值(EEQs).實(shí)際水體的定量檢測(cè)限為2pg·L-1.2結(jié)果與討論2.1地表水主要活性松花江哈爾濱段江水夏秋兩季的雌激素活性如圖1所示.在夏季,江水的雌激素活性(以EEQs計(jì),下同)為550～965pg·L-1,其中水源水A點(diǎn)雌激素活性水平較高,至B點(diǎn)有所降低,隨后變化不大;在秋季,各取樣點(diǎn)江水雌激素活性變化較小,為528～641pg·L-1.Beck等也用重組酵母菌法(YES)測(cè)得夏季德國(guó)波羅的海沿岸地表水的雌激素活性為0.01～0.82ng·L-1,相比低于本研究結(jié)果;Fawell等用此法測(cè)得英國(guó)數(shù)條河流水的雌激素活性為低于檢測(cè)限至2.3ng·L-1,與本研究結(jié)果基本在同一水平上.Bogers等用雌激素受體介導(dǎo)的化學(xué)熒光法()測(cè)得荷蘭境內(nèi)萊茵河與默茲河水的雌激素活性最高分別可達(dá)0.36、9.40ng·L-1,前者EDCs污染程度低于松花江水,后者則遠(yuǎn)高于松花江水;而YES法測(cè)得德國(guó)境內(nèi)萊茵河水9月份的雌激素活性為(1.2±0.4)ng·L-1,顯然與松花江水相當(dāng).在我國(guó)國(guó)內(nèi),關(guān)于地表水EDCs毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)的研究報(bào)道較少,其中Ma等用YES法測(cè)得北京地區(qū)地表水雌激素活性為0.1～4.7ng·L-1,與本研究結(jié)果基本相當(dāng);朱毅等采用MCF-7細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)研究得出長(zhǎng)江、嘉陵江(重慶段)原水也具有類(lèi)雌激素效應(yīng),但無(wú)具體的活性當(dāng)量值報(bào)道;王福玉等也采用YES法調(diào)查了我國(guó)數(shù)個(gè)城市地表水的雌激素活性,發(fā)現(xiàn)50%的地表水樣具有類(lèi)雌激素效應(yīng),但也無(wú)具體的活性當(dāng)量值報(bào)道.從圖1看出,水源地水A雌激素活性較高,相比其它3個(gè)取樣點(diǎn),其水質(zhì)并非最佳,這可能與松花江哈爾濱段江水每天接納上游未經(jīng)處理排放的上百萬(wàn)噸污廢水有關(guān).據(jù)哈爾濱市志記載僅20世紀(jì)80年代就達(dá)到了460萬(wàn)t,致使上游水源地水受污染較為嚴(yán)重,其中的雌激素類(lèi)污染物導(dǎo)致了雌激素活性的升高.構(gòu)成天然水體雌激素活性的主要物質(zhì)為固醇類(lèi)雌激素,而人與動(dòng)物排泄出的此類(lèi)物質(zhì)絕大多數(shù)是以無(wú)活性的葡萄糖醛酸及硫酸鹽結(jié)合態(tài)形式存在,它們?cè)跍囟容^高時(shí)更容易在微生物作用下裂解釋放出雌激素物質(zhì),所以對(duì)于水源水A,可能由于此原因?qū)е麓萍に鼗钚栽跍囟容^高的夏季要稍高一些.另外,夏季雨水沖刷施有農(nóng)肥及農(nóng)藥的農(nóng)田土壤時(shí),將其中的有機(jī)物帶入江水,也會(huì)導(dǎo)致雌激素活性升高.朱毅等研究也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江、嘉陵江各取樣斷面雌激素活性夏季要高于冬季.由于溫度高微生物活性也高,夏季江水雌激素活性的消除也快,加之A點(diǎn)與B點(diǎn)之間相距較遠(yuǎn)(約9000m),所以夏季B點(diǎn)雌激素活性較A點(diǎn)稍有下降.而當(dāng)江水流經(jīng)市區(qū)時(shí),雖然接納了大量未處理或是不完全處理的污廢水,但可能由于EDCs的降解速率與其引入與生成的速率相當(dāng),使得雌激素活性在夏季與秋季變化都較小.另外,D點(diǎn)離市區(qū)較遠(yuǎn)(距C點(diǎn)約6000m),但不論是夏季還是秋季雌激素活性較C點(diǎn)都沒(méi)有很大變化,這可能與江水中一些難降解EDCs及其前驅(qū)物有關(guān),也可能與位于下游的2個(gè)市政污水廠出水有關(guān).2.2彰顯活性原理在水處理和蒸發(fā)過(guò)程中的的生物活性變化自來(lái)水廠進(jìn)廠原水的雌激素活性為456～1105pg·L-1,經(jīng)傳統(tǒng)凈水工藝處理后的出廠水雌激素活性為298～718pg·L-1,去除率為34.6%～50.5%,平均為39.3%.原水經(jīng)混凝沉淀處理后的出水(沉后水)雌激素活性降至404～838pg·L-1,去除率為11.4%～26.1%,平均為18.7%,占總?cè)コ?2.9%～69.0%,平均為47.4%.沉后水經(jīng)砂濾處理后,雌激素活性在4月份變化不大,而在6月份有所升高,5月份與9月份均得到一定程度去除,較沉后水分別降低了20.8%、34.0%.考慮到濾料為均質(zhì)石英砂,本身不含有EDCs,所以推測(cè)原因可能是濾料原來(lái)吸附截留的物質(zhì)在一定條件下又釋放出來(lái),也可能是水體中EDCs前驅(qū)物在濾料表層生長(zhǎng)的微生物作用下得到相應(yīng)降解轉(zhuǎn)化所致.氯消毒使濾后水的雌激素活性在4月份與6月份分別降低了34.3%、34.1%,而在5月份與9月份變化不明顯.胡建英等已證實(shí)自來(lái)水消毒工藝所使用的一些氯消毒劑能與部分EDCs發(fā)生反應(yīng)生成仍具有一定類(lèi)雌激素效應(yīng)甚至雌激素活性更高的消毒副產(chǎn)物,例如雙酚A能在氯氧化過(guò)程中生成雌激素活性更高的副產(chǎn)物,天然有機(jī)物腐殖酸因其具有類(lèi)E2結(jié)構(gòu)也具有一定的雌激素活性,經(jīng)氯消毒后其雌激素活性也能升高.饒凱鋒等也研究發(fā)現(xiàn),原水經(jīng)混凝、氯消毒等傳統(tǒng)工藝處理后其出水仍具有一定雌激素活性,甚至有時(shí)較進(jìn)水有升高現(xiàn)象發(fā)生,但他們用該法測(cè)得的水廠原水及各工藝單元出水的雌激素活性遠(yuǎn)小于本研究結(jié)果,為幾十pg·L-1.從上看出,自來(lái)水廠所使用的3種凈水工藝中,以混凝沉淀工藝對(duì)雌激素活性的去除最為穩(wěn)定,而砂濾與氯消毒工藝則帶有一定的隨機(jī)性,出水不穩(wěn)定.從圖2看出,不論是原水還是各工藝單元出水,基本上都以6月份雌激素活性最高,其次為9月份,以4月份與5月份較低.4次取樣中6月份為夏季,氣溫較高,此時(shí)引入水廠的江水雌激素活性也高,9月份進(jìn)入秋季,天氣轉(zhuǎn)涼,氣溫下降,江水雌激素活性也降低,而4月份與5月初氣溫都較低,江水雌激素活性也低.比較圖2中同步取樣的出廠水與管網(wǎng)水雌激素活性,可以看出,出廠水經(jīng)長(zhǎng)距離管網(wǎng)輸送后雌激素活性有所升高,其中9月份變化不大,4月份升高最明顯,升高了44.9%,說(shuō)明管網(wǎng)輸送過(guò)程中產(chǎn)生了二次污染.鐵質(zhì)水管為了防止生銹,往往涂環(huán)氧樹(shù)脂作保護(hù)膜,而環(huán)氧樹(shù)脂的主要生產(chǎn)原料雙酚A(BPA)為典型EDCs中的一種,有研究表明環(huán)氧樹(shù)脂涂層中BPA的單位面積溶出濃度為0.4～5.6μg·m-2;除了BPA,常用于自來(lái)水管(襯塑管、塑料管、接頭密封橡膠圈等)的合成材料還包括壬基酚、辛基酚、鄰苯二甲酸酯類(lèi)等,這些EDCs在和水的長(zhǎng)期接觸中將會(huì)逐步從管材中溶出.例如,壬基酚在合成橡膠中的單位面積最大溶出濃度為240μg·m-2,在聚乙烯給水管中的最低溶出濃度為1μg·m-2.依此推測(cè),可能由于這些典型EDCs在管材中的溶出,導(dǎo)致了管網(wǎng)末端用戶飲用水雌激素活性的升高.當(dāng)然,也可能是污染物在長(zhǎng)距離管網(wǎng)輸送過(guò)程中發(fā)生了轉(zhuǎn)化或相互作用而導(dǎo)致毒性發(fā)生了變化.2.3管網(wǎng)水激素活性2006年9、10月及2007年1、4、5、6、9月管網(wǎng)水7次取樣測(cè)得雌激素活性分別為532、1362、1128、468、347、785和543pg·L-1,以2006年10月的雌激素活性最高,2007年5月最低,平均值為738pg·L-1.2006年9月與2007年9月的管網(wǎng)水雌激素活性則大致相當(dāng),而2006年10月與2007年1月2次取樣中管網(wǎng)水雌激素活性較高,原因尚不明,還需進(jìn)一步深入研究,如對(duì)水樣萃取物進(jìn)行分級(jí)處理來(lái)分離出雌激素活性組分,再通過(guò)各種儀器分析手段定性定量產(chǎn)生雌激素活性的主要物質(zhì).相比,哈爾濱市管網(wǎng)水雌激素活性明顯要高于荷蘭管網(wǎng)水0.06～0.47ng·L-1的報(bào)道.除此外,目前針對(duì)管網(wǎng)水雌激素活性評(píng)價(jià)的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道很少,很難進(jìn)行對(duì)比研究,但就相比前面地表水雌激素活性的研究報(bào)道來(lái)看,哈爾濱市管網(wǎng)水EDCs污染較為嚴(yán)重,雌激素活性與大多數(shù)地表水相當(dāng).雌激素活性可全面反映水體中所有EDCs對(duì)生物體的綜合效應(yīng),但目前國(guó)內(nèi)外都缺乏一種有效的