杠柳毒苷在模擬人體消化道液中的穩(wěn)定性研究

杠柳毒苷在模擬人體消化道液中的穩(wěn)定性研究

甘氨酸是中藥科加皮科的主要強心成分。它的結(jié)構(gòu)成本包括甘氨酸d-（加拿大麻糖）-d-（葡萄糖）?，F(xiàn)代藥理研究表明,杠柳毒苷強心作用具有速度快,持續(xù)時間短,無蓄積作用等特點。目前香加皮作為傳統(tǒng)中藥多用于治療心力衰竭的復(fù)方中,以口服方式給藥,國內(nèi)外對其在機體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化尚無研究。對于口服給藥方式,藥物在消化道內(nèi)的穩(wěn)定性是其在機體內(nèi)吸收、代謝和起效的一個重要環(huán)節(jié),因此筆者對杠柳毒苷在體外模擬消化液中的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化情況進行考察,以便進一步對其體內(nèi)代謝進行研究,為指導(dǎo)合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。1實驗部分1.1液相色譜及質(zhì)譜Waters515高效液相色譜系統(tǒng),Waters2487紫外檢測器;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng):HP1100高效液相色譜系統(tǒng)(配二極管陣列檢測器)、Finnigan離子阱質(zhì)譜儀(LCQAdvantageMax,USA,ESI離子源);AX205分析天平、DELTA320pH計,恒溫水浴、臺式離心機;杠柳毒苷對照品(本所自制),胃蛋白酶和胰蛋白酶(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司),乙腈(色譜純),超純水,其他試劑為分析純。1.2測量條件1.2.1色譜柱及色譜條件AgilentZorbaxC18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA),流動相為乙腈∶水(29∶71),流速為1mL/min,柱溫為室溫,檢測波長220nm。1.2.2液質(zhì)條件AgilentZorbaxC18色譜柱(2.1mm×150mm,5μm,Agilent,USA),流動相為甲醇∶水(40∶60),流速為0.2mL/min,柱溫為25℃,檢測波長220nm。質(zhì)譜參數(shù):噴霧電壓4.5kV,毛細管溫度300℃,毛細管電壓37V,殼氣流速40arb,輔助氣流速5arb,正離子模式,MS監(jiān)測m/z=190~900總離子流信號,MS/MS模式,碰撞能量20%,監(jiān)測m/z=100~900總離子流信號。1.3含量測定的方法與文本研究1.3.1最大劑量設(shè)計目標(biāo)精密稱取10mg杠柳毒苷對照品,置于100mL容量瓶中,用水溶解定容至刻度,搖勻,即得杠柳毒對照品貯備液,濃度為0.10mg/L。精密吸取杠柳毒苷對照品貯備液適量,用水配制成濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20mg/L的杠柳毒苷對照品溶液,進樣10μL,每個濃度平行操作3份,以峰面積(Y)平均值為縱坐標(biāo),進樣量(X)為橫坐標(biāo)作圖,得回歸方程為Y=1.47×104X-8.20×102,r=0.9999,線性范圍為0.002~0.2μg。1.3.2低、中、濃度杠柳毒苷峰面積rsd精密吸取杠柳毒苷對照品貯備液適量,用水配制成濃度分別為0.6、3、15mg/L的杠柳毒苷對照品溶液,每個濃度重復(fù)進樣5次,測得低、中、高濃度杠柳毒苷峰面積(RSD)分別為2.9%、1.9%、1.7%。1.3.3模擬藥樣的檢測考察與模擬胃液離子強度相當(dāng)?shù)娜芤汉湍M小腸液中測定的準(zhǔn)確度。精密吸取杠柳毒苷對照品貯備液適量,分別用與模擬胃液離子強度相當(dāng)?shù)娜芤篬0.05mol/L氯化鈉(NaCl)溶液]和模擬小腸液(pH=6.8磷酸鹽緩沖液)配制成濃度分別為0.6、3、15mg/L杠柳毒苷對照品溶液,進樣10μL,將測得的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得杠柳毒苷的含量,每個濃度平行操作5份。測得模擬胃液低、中、高濃度杠柳毒苷的回收率分別為103.4%、102.7%、101.3%,RSD分別為1.3%、1.9%、1.6%;模擬腸液低、中、高濃度杠柳毒苷的回收率分別為100.5%、101.9%、102.8%,RSD分別為2.7%、2.2%、0.9%。1.4模擬消化液穩(wěn)定性研究1.4.1模擬條件和模擬方法胃液的主要成分是胃酸(鹽酸),空腹時胃液的pH值為0.9~1.5,飲水或進食后pH值可上升為3.0~5.0;小腸液的pH值為5.0~7.4,大腸液的pH值為8.0~9.0。本實驗依據(jù)《中國藥典》2005版,配制模擬空腹胃液和模擬小腸液,在此基礎(chǔ)上采用碳酸鈉(Na2CO3)溶液和氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值配制模擬進食胃液和大腸液。每100mL模擬空腹胃液加1g胃蛋白酶,每100mL模擬小腸液加1g胰蛋白酶,作為含酶模擬消化液。配制的6種模擬消化液包括:空腹胃液(含酶、無酶)pH值為1.2,進食胃液(無酶)pH值為4.9,小腸液(含酶、無酶)pH值為6.8,大腸液(無酶)pH值為8.7。1.4.2模擬消化液配制精密吸取杠柳毒苷對照品貯備液0.3mL,分別用以上6種模擬消化液稀釋至2mL,渦旋混勻,樣品溶液濃度為含杠柳毒苷15mg/L。1.4.3樣品含量測定將1.4.2項下的每種消化液樣品分別分裝至6支具塞試管中放置于37℃水浴中,于0、0.5、1、1.5、2、4、6h取樣進行含量測定,含酶的樣品用乙腈稀釋1倍后4000r/min離心5min取上清液測定,進樣量10μL,實驗在不同天重復(fù)3次。2結(jié)果2.1酶活性測定結(jié)果杠柳毒苷在不同模擬消化液中的穩(wěn)定性有所差異,在空腹胃液中隨時間含量逐漸降低,1h含量降低22.3%,6h降低79.4%,在色譜圖中約在10.9min處有一新峰產(chǎn)生,見圖1。在無酶的空腹胃液、進食胃液、小腸液、大腸液中0~6h含量無變化,結(jié)果見表1。另外,分別對無酶和含酶的空腹胃液見圖2、小腸液見圖3進行比較,結(jié)果說明加入胃蛋白酶、胰蛋白酶對其含量變化沒有明顯影響。2.2esi-ms質(zhì)譜特性對杠柳毒苷在模擬空腹胃液中出現(xiàn)的水解產(chǎn)物進行定性分析。該物質(zhì)經(jīng)薄層板分析用3,5-二硝基苯甲酸和NaOH交替顯色后呈紫紅色,證明其可能有強心苷母核;對其進行ESI-MS一級和二級質(zhì)譜分析,正離子模式全譜中顯最強峰m/z391,符合杠柳苷元[M+H]+離子,見圖4。以20%的能量對該離子進行二級質(zhì)譜分析,得到了m/z373、355、337碎片離子,見圖5,應(yīng)是杠柳苷元上3個羥基連續(xù)脫去一分子水(H2O)得到。說明杠柳毒苷在模擬空腹胃液出現(xiàn)的這一新物質(zhì)為杠柳苷元。3不同的d-加拿大麻糖和d-葡萄糖的杠柳苷元在消化液環(huán)境下的穩(wěn)定性模擬消化液的pH值是影響杠柳毒苷穩(wěn)定性的重要因素。杠柳毒苷在pH=1.2的模擬空腹胃液環(huán)境中不穩(wěn)定,水解產(chǎn)物為脫去糖基部分(D-加拿大麻糖和D-葡萄糖)的杠柳苷元,在其他模擬消化液環(huán)境中6h內(nèi)穩(wěn)定。這主要是由于糖