寶大蒜氣生鱗莖快繁技術(shù)研究

寶大蒜氣生鱗莖快繁技術(shù)研究

大蒜是百合科的一種杏仁科。在中國種植了2000多年，并在全國范圍內(nèi)種植。大蒜以鱗莖(地蒜)、蒜薹和幼株食用,還可以生產(chǎn)青蒜和蒜黃,是群眾最喜愛的主要蔬菜之一。寶坻大蒜“六瓣紅”是津沽名優(yōu)特產(chǎn)之一,營養(yǎng)價值高,具有強力殺菌、防治癌癥、排毒清腸、降低血糖和防治心腦血管疾病等功效。但是大蒜通常以蒜瓣進行無性繁殖,在長期的無性繁殖過程中,因病毒逐年積累并代代相傳,使種性逐漸退化,蒜頭變小,產(chǎn)量、品質(zhì)大幅下降。大蒜采用氣生鱗莖(天蒜)繁殖時,天蒜采自蒜薹(花薹)頂端的花苞(生長點),而大蒜生長點部位一般不帶病毒,因而可自然脫毒。目前已建立了以莖尖、根尖、全展葉、貯藏葉、莖盤切塊和花原始體等為外植體的大蒜組織培養(yǎng)再生體系。大蒜的離體再生途徑主要有愈傷組織途徑和不定芽途徑。愈傷組織途徑是通過外植體的脫分化實現(xiàn)的,但是愈傷組織再生途徑的效率不高,因此建立一種新的高效的大蒜快繁體系是非常必要的。大蒜氣生鱗莖在生產(chǎn)實踐上主要被用來提純及復壯,但由于只有成熟的氣生鱗莖才能做“種子”,而培養(yǎng)成熟的氣生鱗莖會爭奪地蒜的營養(yǎng),影響地蒜的產(chǎn)量,降低種蒜的收益。該研究利用未成熟的大蒜氣生鱗莖作為外植體直接誘導試管苗,使大蒜實現(xiàn)天然脫毒的同時,又避免愈傷組織途徑脫分化、再分化、繁殖系數(shù)低以及容易產(chǎn)生遺傳變異的缺憾,同時不影響地蒜的正常生長,以期為寶坻大蒜的脫毒快繁和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎。1材料和方法1.1試驗材料供試材料為寶坻大蒜“六瓣紅”的氣生鱗莖。1.2測試方法1.2.1氣生嘴唇形態(tài)觀察選取3個花苞,按體積的大小從中挑取10顆氣生鱗莖進行排序,分別稱量并記錄氣生鱗莖重量,并進行形態(tài)學解剖,觀察其是否含有貯藏葉。統(tǒng)計重量為何值時氣生鱗莖中不再含有貯藏葉。因為只有含有貯藏葉,氣生鱗莖才有可能誘導生成試管苗。3次重復。1.2.2培養(yǎng)基的制備以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加不同種類和濃度的激素,pH5.8;高溫高壓滅菌20min;待冷卻至60℃時,分裝到200mL的組培瓶中,每瓶約35mL,蓋緊瓶蓋備用。試驗中所用培養(yǎng)基為:試管苗誘導培養(yǎng)基:MS基礎培養(yǎng)基+1.0mg/LNAA+5.0mg/LKT;試管苗生根培養(yǎng)基:MS基礎培養(yǎng)基。1.2.3大蒜氣生英鎊的低溫處理在不影響地蒜生長的前提下將尚未成熟的花苞采摘下來,4℃保存,共設置低溫7、14、28、84d4個處理,用于試管苗誘導試驗。1.2.4試苗誘導處理取生長良好有貯藏葉的寶坻大蒜氣生鱗莖,用75%的乙醇浸泡10min,用無菌水沖洗,濾紙吸干,再用0.1%的HgCl2滅菌10min,用無菌水沖洗3次,濾紙吸干,接入試管苗誘導培養(yǎng)基上,每瓶接入7顆氣生鱗莖,每個處理20瓶,按1.2.3下的方法低溫處理。培養(yǎng)條件為日溫25℃,夜溫20℃,光照1500lx,光照時間14h/d。培養(yǎng)49d,每7d進行觀察統(tǒng)計誘導率。1.2.5生根培養(yǎng)將誘導出來的生長旺盛的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,誘導生根,生根培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基。35d之后統(tǒng)計生根率。1.2.6壯苗和小植株的移栽和栽植生根后的試管苗,待其長到3片真葉、生根3~4條時,室溫開瓶練苗,7~10d后將小植株從試管中取出,洗去根部培養(yǎng)基將其移栽至滅菌的珍珠巖、蛭石和泥炭土(1∶3∶6)中,移栽后保持日溫25℃,夜溫15℃,在組織培養(yǎng)室中放置30d壯苗,之后移栽到大田。1.2.7卡諾固定液待地蒜根(對照)和氣生鱗莖誘導的試管苗的根長到1cm時將根取下,用卡諾固定液固定24h,于70%乙醇中保存,用于染色體觀察。將根在1mol/L鹽酸、60℃條件下解離8min,蒸餾水沖洗3遍,用濾紙將處理好的根擦干,取根尖,用卡寶品紅染色8min,壓片,進行染色體的觀察。2結(jié)果與分析2.1氣生莖重量對作酒精度的預測氣生鱗莖是否含有貯藏葉是其能否發(fā)芽的關(guān)鍵,只有含有貯藏葉的氣生鱗莖才有可能被誘導生成試管苗,所以,在氣生鱗莖誘導培養(yǎng)之前,對不同大小的氣生鱗莖做形態(tài)學解剖,找出氣生鱗莖的重量與是否含有貯藏葉之間的關(guān)聯(lián),最終通過稱重挑選帶有貯藏葉的氣生鱗莖進行試管苗誘導。從表1可以看出,在第1組中重量為0.0093g的氣生鱗莖含有貯藏葉,重量為0.0076g的氣生鱗莖不含有貯藏葉,第2組中重量為0.0089g的含有貯藏葉,重量為0.0078g的不含有貯藏葉,在第3組中重量為0.0088g的含有貯藏葉,重量為0.0082g不含有貯藏葉。3次試驗中不含貯藏葉的氣生鱗莖重量的平均值為0.009g,所以,選取重量大于0.009g的氣生鱗莖用于試管苗的誘導,棄掉重量小于0.009g的氣生鱗莖。2.2低溫處理對氣生培養(yǎng)后培養(yǎng)率的影響從表2可以看出,低溫處理7、14、28、84d的氣生鱗莖,培養(yǎng)7d后,前3種處理的氣生鱗莖誘導率基本相近,分別為2.09%、2.16%、2.12%,而低溫處理84d的氣生鱗莖,培養(yǎng)7d后誘導率為0,到21d時才達到2.24%,此時低溫處理14d的氣生鱗莖誘導率已經(jīng)達到47.47%;培養(yǎng)到第70天時,試管苗的誘導率分別為68.61%、81.66%、34.24%、38.65%,顯然低溫處理14d的氣生鱗莖萌發(fā)率和試管苗的誘導率都高于其它低溫處理組。2.3氣生嘴唇誘導生成苗由圖1可以看出,在接入誘導培養(yǎng)基7d后,氣生鱗莖的表面開始變綠(圖B);生長14d后,部分氣生鱗莖的內(nèi)部開始長出嫩芽(圖C);21d后,氣生鱗莖誘導生成的苗逐漸長大,數(shù)量開始增多,誘導率逐漸增大(圖D);生長28d后,氣生鱗莖誘導出的苗不斷生長,出苗率不斷增加;發(fā)育至49d時,苗已長至10cm左右,生長強壯、呈深綠色(圖E-H)。每個寶坻大蒜的花苞平均含有70顆氣生鱗莖,其中65顆含有貯藏葉,可用于試管苗的誘導,一個花苞平均可以獲得試管苗40株(繁殖系數(shù)為40),與用地蒜繁殖大蒜(繁殖系數(shù)為6)相比,效率提高了6.67倍。2.4數(shù)的試苗的生根有9%的氣生鱗莖試管苗在誘導培養(yǎng)基上出現(xiàn)生根現(xiàn)象,但絕大多數(shù)的試管苗沒有生根。將未生根的試管苗接種在生根培養(yǎng)基上(MS基礎培養(yǎng)基),6d后,部分試管苗出現(xiàn)生根現(xiàn)象,繼續(xù)培養(yǎng)到45d時,試管苗的生根率達到95%以上(圖2)。2.5提高組培苗的培養(yǎng)、栽培苗的種植和使用的能力為了提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應性,提高其光合作用的能力,促使組培苗健壯,移栽成活率高,試管苗必需經(jīng)過一段時間的練苗后方可移栽。該研究共移栽試管苗330株,成活330株,成活率為100%。2.6細胞分裂期圖從圖3可以看出,A為大蒜根尖細胞分裂前期圖,B為細胞分裂中期圖,能清晰的看出細胞中含有16條染色體。C為細胞分裂后期圖。D為氣生鱗莖試管苗根尖細胞分裂前期圖,B為細胞分裂中期圖,能清晰的看出細胞中含有16條染色體。F為細胞分裂后期圖。上述結(jié)果說明,用氣生鱗莖直接誘導的試管苗細胞染色體數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,誘導過程中沒有發(fā)生染色體變異,進一步說明不經(jīng)過脫分化和再分化過程,對保持大蒜品種的遺傳特性有現(xiàn)實意義。3大蒜氣生莖的提取與貯藏技術(shù)用大蒜愈傷組織進行脫毒和快繁雖然有諸多優(yōu)點,但大蒜愈傷組織在脫分化和再分化過程中普遍存在著染色體的高變異率,Maggioni等用葉片外植體誘導的愈傷組織,只有45.9%的細胞是二倍體,其它為八倍體、三倍體、四倍體、非整倍體,還有20%的細胞含很多染色體。為了保持大蒜的遺傳特性,同時又能進行大蒜的脫毒、快繁,生產(chǎn)上常常用成熟的氣生鱗莖做“種子”進行大蒜提純、復壯繁殖。張紹文等對大蒜氣生鱗莖利用價值進行研究,發(fā)現(xiàn)用成熟的天蒜播種,其增殖倍數(shù)均在30倍以上,但留天蒜植株的地蒜產(chǎn)量較不留株減產(chǎn)22.6%~33.0%。該研究建立了用未成熟的氣生鱗莖進行大蒜脫毒快繁的技術(shù)體系,在不影響地蒜生長的情況下實現(xiàn)了大蒜快繁。大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)受到貯藏時間、溫度、氣生鱗莖大小、植物激素配比等多種因素的影響。低溫處理時間對氣生鱗莖試管苗的誘導率有一定的影響,李小川等、Seabrook認為氣生鱗莖在4℃的低溫條件下貯藏一定的時間能夠打