多孔聚乳酸海綿材料在組織工程修復(fù)中的應(yīng)用

多孔聚乳酸海綿材料在組織工程修復(fù)中的應(yīng)用

目前，皮膚傷口修復(fù)中使用的主要皮膚損傷修復(fù)方法主要包括異體皮、無細(xì)胞皮、合成皮和其他皮膚素。但以上真皮替代物由于免疫反應(yīng)、缺乏活細(xì)胞或支架材料難以塑性等缺點而未能得到廣泛的應(yīng)用。聚乳酸是一種生物降解醫(yī)用高分子材料。它具有良好的生物醫(yī)學(xué)性能,與人體組織的相容性良好,無致癌和變態(tài)反應(yīng),有相當(dāng)?shù)膹姸群湍途眯?并具有良好的加工性能。本實驗利用鹽溶法將聚乳酸制成多孔的海綿材料,將其作為支架,接種皮膚成纖維細(xì)胞,探討其在人工真皮構(gòu)建中的作用。1材料和方法1.1、胎牛血清、聚乳酸溶液皮膚組織來源于合法流產(chǎn)胎兒背部;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;聚乳酸[均聚丙交酯或聚乳酸(PLA)]由中國科學(xué)院化學(xué)研究所王身國教授惠贈;免疫組化試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1真核實機細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照鄂征主編的《組織培養(yǎng)》中描述的胰酶消化方法,分離表皮和真皮,分離得到的真皮用625U/ml膠原酶消化后,將真皮成纖維細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后,離心。用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按20～40×103/ml細(xì)胞密度將成纖維細(xì)胞接種到上述培養(yǎng)基中。12h后換1次液體,以后3天換1次液體,觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞長到80%后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化,按1∶4傳代。取第3～5代對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗。1.2.2聚乳酸溶液nacl顆粒參考Shastri和王晶等報道的鹽溶法(或粒子瀝濾法),將氯仿加入聚乳酸中,充分溶解,使其終濃度為4%,取4.5gNaCl顆粒(80目濾網(wǎng)過篩)分散于聚乳酸溶液中,傾倒入合金平底鍋中,常溫?fù)]發(fā)48h后,蒸餾水浸泡36h,每6h換水1次,自然晾干,待用。同時,將聚乳酸溶液直接倒入鋁制鍋中,獲得無孔的聚乳酸薄膜。1.2.3消化酶的提取將對數(shù)生長期的皮膚成纖維細(xì)胞,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化收集后,將其濃度調(diào)節(jié)為2～4×106/ml,負(fù)壓抽吸,37℃孵箱靜止培養(yǎng)5h,然后加正常培養(yǎng)液,以后隔天換液。1.2.4聚乳酸膜的制備將含有0.1×106/ml的細(xì)胞懸液,滴加到6塊1cm2大小的聚乳酸膜上,2h后,PBS清洗,除去未粘附細(xì)胞。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù),取平均數(shù),計算皮膚成纖維細(xì)胞在聚乳酸材料上的貼附率。1.2.5甲基苯胺藍(lán)染色將培養(yǎng)2周的標(biāo)本用甲基纖維素包埋后,作冷凍切片。甲苯胺藍(lán)染色15min,酒精逐級脫水后封片,光鏡觀察。1.2.6透射電鏡觀察將培養(yǎng)2周的結(jié)構(gòu)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的多聚甲醛室溫下固定1h,PBS沖洗后送檢。1.2.7細(xì)胞生長曲線的繪制分別取3塊培養(yǎng)至第1天、1周、2周和3周的結(jié)構(gòu)物,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,收集細(xì)胞計數(shù),取平均數(shù)繪制生長曲線。1.2.8免疫組化將培養(yǎng)2周的標(biāo)本用甲基纖維素包埋,作冷凍切片。進(jìn)行Ⅰ型膠原的免疫組化染色(過程同說明書)。2結(jié)果2.1細(xì)胞融合傳代動力學(xué)細(xì)胞接種后4～5h,可以看到成纖維細(xì)胞貼壁、展開呈多角形。7～10天后,細(xì)胞融合,長滿80%,可進(jìn)行傳代。傳代細(xì)胞接種到PLA泡沫材料上,2h后,圓形成纖維細(xì)胞消失,細(xì)胞在支架材料上展開。2.2子固碳率的檢測在6塊PLA膜上粘附的細(xì)胞數(shù)和粘附率見表1。2.3成纖維細(xì)胞核的形態(tài)培養(yǎng)2周的結(jié)構(gòu)物經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后(見封二圖1),可以看到,成纖維細(xì)胞胞核呈藍(lán)色著色,細(xì)胞附著在支架材料網(wǎng)孔的表面,密度較大。支架材料未見明顯吸收。2.4透射電鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞核無固縮、無裂解。胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,并有少量的吞噬小泡。胞外有不成熟的膠原分泌(見封二圖2)。2.5成纖維細(xì)胞的生長曲線由細(xì)胞生長曲線可見(圖3),細(xì)胞在PLA支架材料上,1～2周內(nèi)基本處于停滯狀態(tài),隨著時間的延長,細(xì)胞數(shù)略有增殖。2.6免疫組化Ⅰ型膠原呈強陽性著色,膠原間藍(lán)色區(qū)域為襯染后的成纖維細(xì)胞(見封二圖4)。3組織工程含皮質(zhì)量的皮人工皮膚組織是解決大面積燒傷患者皮源缺乏的重要途徑。最初應(yīng)用于臨床的皮膚替代物是由體外培養(yǎng)的自體表皮膜片,但存在膜片太薄、操作困難、愈合后上皮組織彈性不佳、耐磨性差、易發(fā)生破潰和收縮等缺點。而真皮替代物的出現(xiàn)不僅克服了上述不足,還能提高角朊細(xì)胞膜片的移植成功率。除此之外,真皮替代物還可單獨應(yīng)用于大面積深度燒傷的患者。所以,它的開發(fā)是近年來皮膚創(chuàng)面覆蓋物研究的新熱點。目前存在的真皮替代物主要有3種:異體真皮、無細(xì)胞真皮基質(zhì)和合成真皮基質(zhì)。異體真皮主要指去除表皮,源于尸體的異體真皮,它雖有立即應(yīng)用的優(yōu)點,但存在一定的免疫反應(yīng);無細(xì)胞真皮基質(zhì)也叫去表皮的死真皮,即在異體真皮的基礎(chǔ)上去除了細(xì)胞成分,它比較容易使用、消毒和儲存,但因缺乏活的成纖維細(xì)胞,而延緩了真皮的重建,此外,也同樣存在免疫反應(yīng)的問題;合成真皮基質(zhì)多為化學(xué)合成的網(wǎng)膜結(jié)合膠原、細(xì)胞或其他成分形成的一種真皮替代物。組織工程真皮即屬于這一類。它的構(gòu)建思路是,利用生物學(xué)和工程學(xué)原理研究、開發(fā)用于修復(fù)、維持和改善損傷的真皮組織。具體的方法是將體外培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞與適當(dāng)?shù)陌饣|(zhì)相結(jié)合,然后將其移植到病損部位。由于細(xì)胞成分來源患者本身,選擇的基質(zhì)材料生物相容性較高,而且活性成纖維細(xì)胞的存在可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長分化,誘導(dǎo)基底膜形成,故在皮膚重建中起著重要的作用。與此同時,尋找一種在生物相容性、空間結(jié)構(gòu)、機械強度等方面均有利于組織重建的、理想的胞外基質(zhì)材料也顯得尤為重要。聚乳酸是經(jīng)FDA認(rèn)證可應(yīng)用于臨床的,以微生物發(fā)酵產(chǎn)物——乳酸為單體化學(xué)合成的一類高分子聚合物。它是一種無毒、無刺激性、具有良好生物相容性、可生物分解吸收、強度高、可塑性加工成型的高分子材料。它的降解產(chǎn)物是乳酸,可以參與人體內(nèi)糖類代謝循環(huán)。目前已經(jīng)實用化的聚乳酸材料產(chǎn)品有縫合線、骨結(jié)合部位固定材料、組織缺損修復(fù)功能等。AdvancedTissueSciences公司生產(chǎn)的真皮替代物Dermagraft即是由新生兒成纖維細(xì)胞種植在可降解的聚乳酸纖維網(wǎng)上組成,現(xiàn)已成功用于治療糖尿病性潰瘍。多孔的海綿狀聚乳酸支架材料具有較大的表面積和高孔隙率,利于細(xì)胞的粘附和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞及代謝產(chǎn)物的交換,可以更加充分地發(fā)揮其組織再生的潛力。在本試驗中,我們應(yīng)用鹽溶法制作了多孔的聚乳酸海綿狀材料,將其作為真皮支架,為細(xì)胞的貼壁、增殖提供了足夠的立體空間。接種皮膚成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞附著在支架材料上,其粘附率高達(dá)82.3%,細(xì)胞無異常代謝和死亡,說明該材料對細(xì)胞無明顯毒性和刺激性,能夠支持皮膚成纖維細(xì)胞的正常生長和代謝。細(xì)胞的緩慢增殖恰恰與體內(nèi)皮膚成纖維細(xì)胞的狀態(tài)相類似。透射電鏡下觀察,成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)良好;發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),說明在支架材料上的成纖維細(xì)胞正處于旺盛的蛋白合成狀態(tài);吞噬小泡的出現(xiàn)提示我們,成纖維細(xì)胞對聚乳酸材料可能有一定的吸收作用。透射電鏡下豐富的胞外膠原基質(zhì)和Ⅰ型膠原免疫組化染色表明,支架材料上的皮膚成纖維細(xì)胞膠