rca法檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌利福平的應(yīng)用

rca法檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌利福平的應(yīng)用

近年來(lái)，分枝桿菌的抗劑率不斷提高，尤其是多重抗劑菌的比例不斷增加，耐藥性的表現(xiàn)為對(duì)主要一線藥物的抗劑和多種藥物的抗劑。因此，我們尤其重要地快速、準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)核糖桿菌對(duì)主要一線藥物的耐藥性，以及早期有效化療和核電站疫情的控制。利福平(rifampin,RIF)是重要的臨床一線抗結(jié)核藥物,據(jù)統(tǒng)計(jì)約90%以上RIF耐藥菌株對(duì)異煙肼也耐藥,因此RIF耐藥也可作為MDR-TB的標(biāo)志?；诟牧剂_氏培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)是診斷結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的金標(biāo)準(zhǔn),該方法技術(shù)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易推廣,可進(jìn)行11種一線、二線藥物的藥物敏感試驗(yàn),但培養(yǎng)陽(yáng)性率較低,細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢,時(shí)間較長(zhǎng)(2~3個(gè)月),不能滿足臨床早期診斷與治療的需要。滾環(huán)擴(kuò)增是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種恒溫?cái)U(kuò)增方法。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA,還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的信號(hào)放大,靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子水平。因此,RCA技術(shù)在全基因組擴(kuò)增、單核苷酸多態(tài)性、DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片等方面檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。本文以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)絕對(duì)濃度法為金標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估RCA技術(shù)快速直接檢測(cè)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的敏感性,從而評(píng)價(jià)該技術(shù)在我國(guó)的實(shí)際臨床應(yīng)用的可能和價(jià)值。1來(lái)自本地格式的資源1.1核電站的樹(shù)枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27294)本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2氣本組患者采集2012年8至12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院的涂片陽(yáng)性的初治肺結(jié)核患者24h痰標(biāo)本12份,復(fù)治肺結(jié)核患者晨痰標(biāo)本20份,共32份。2主試劑和設(shè)備2.1特效藥利福平(RIF)(SIGMA公司,批號(hào)080M15106V)2.2table-pcr檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司);1%TAE緩沖液,瓊脂糖;2×TaqPCRMastermix酶,100bpDNAMarker(北京天根生化技術(shù)有限公司);Pfu連接酶(美國(guó)安捷倫科技公司);ExoI外切酶,ExoIII外切酶,SybGreen染料(大連TaKaRa公司),20%吐溫80,AlarmarBlue指示劑(批號(hào)020611A,美國(guó)BIO-RAD公司)。2.3利福平儲(chǔ)液的制備稱取80mg利福平溶于1mLDMSO中(80mg/mL)。2.4pcr系統(tǒng)和成像系統(tǒng)RealtimesteponeplusPCR儀(型號(hào)272004559,上海ABI公司);電熱恒溫水浴鍋;德國(guó)Eppendorf梯度PCR儀(型號(hào)6325ZQ011275),DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);Tanon-4200全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);CO2培養(yǎng)箱。3方法3.1通過(guò)處理痰樣3.1.1溶液的配制約2mL的痰液中加入2~3倍的4%NaOH,搖勻,室溫下放置30min左右充分液化;取200μL接種于7H11培養(yǎng)基,置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4周。3.1.2熱離心時(shí)間(采用結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒方法)取0.5mL液化痰至1.5mL離心管中,加入0.5mL4%NaOH室溫放置10min后15000r/min離心5r/min;取上清,沉淀加無(wú)菌生理鹽水1mL混勻,15000r/min離心5min;加50μLDNA提取液充分混勻,沸水浴10min,轉(zhuǎn)至4℃靜置過(guò)夜以保證充分裂解;10000r/min離心5min,取上清做PCR反應(yīng)。3.2pcr擴(kuò)增3.2.1熱點(diǎn)突變區(qū)的設(shè)計(jì)和合成37RvrpoB基因的標(biāo)準(zhǔn)序列。結(jié)核分枝桿菌rpoB基因全長(zhǎng)3519bp,其507~533位氨基酸密碼子被稱為“熱點(diǎn)突變區(qū)”。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增涵蓋此突變區(qū)的835~1463bp的DNA片段(見(jiàn)表1)。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增片段:629bp。引物的特異性及是否形成引物二聚體通過(guò)PrimePremier5.0進(jìn)行分析檢驗(yàn)。3.2.2dna模板選擇使用25μL總反應(yīng)容積各1μL上下游引物(10μmol/L),12.5μL2×TaqPCRMasterMix,3μLDNA模板及7.5μL去離子水。3.2.3pcr擴(kuò)增程序94℃2min;94℃15s,62℃30s,72℃1min,共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。3.2.4擴(kuò)張完成后，將其保存在4c下3.3判定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將5μLPCR產(chǎn)物與1μL10×loadingbuffer混勻并上樣,104V電壓;40min后,終止電泳,凝膠成像儀中拍照。3.4rca的環(huán)化3.4.1檢測(cè)來(lái)自大連TAKARA公司合成(見(jiàn)表1)。3.4.2合成ligae及7.5lpcr產(chǎn)物使用10μL總反應(yīng)容積:1μL探針(1μmol/L),1μLbuffer,0.5μLPfuligase及7.5μLPCR產(chǎn)物。3.4.3環(huán)境處理95℃,62℃循環(huán)1次;95℃,62℃循環(huán)8次。3.5rca檢測(cè)3.5.1lexoii表達(dá)使用20μL總反應(yīng)容積:10μL環(huán)化產(chǎn)物,1μLbuffer,0.5μLEXOI外切酶,0.1μLEXOIII外切酶及7.4μL去離子水。3.5.2水解反應(yīng)方案37℃60min,95℃3min。3.6ybger染料法采用realtimePCR相對(duì)定量,SybGreen染料法:應(yīng)用RCA擴(kuò)增引物,在等溫條件下將環(huán)形探針擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中,加入過(guò)量SybGreen熒光染料。3.6.1擴(kuò)大引物的合成和設(shè)計(jì)RealTimePCR檢測(cè)引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成(見(jiàn)表1)。3.6.2復(fù)合無(wú)酶水檢測(cè)使用25μL總反應(yīng)容積各1μL上下游引物(10μmol/L),3μL環(huán)化產(chǎn)物,12.5μLSybGreen及7.5μL去離子水。無(wú)酶水組檢測(cè)使用25μL反應(yīng)容積:各1μL上下游引物(10μmol/L),3μL無(wú)酶水,12.5μLSybGreen及7.5μL去離子水(無(wú)酶水組以無(wú)酶水為DNA模板,體系其他成分一樣,目的排除試劑的污染)。96孔板排列分布情況見(jiàn)表2。根據(jù)熒光信號(hào)的擴(kuò)增曲線圖進(jìn)行分析,見(jiàn)圖1。3.7突變位點(diǎn)和分型分析結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變情況將32株結(jié)核分枝桿菌PCR產(chǎn)物送至北京華大基因公司測(cè)序,結(jié)果與rpoB標(biāo)準(zhǔn)序列比較分析,確定突變位點(diǎn)和分型。3.8菌株鑒定結(jié)果用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落,研磨并配置1麥?zhǔn)瞎軡舛染鷳乙?接種至含利福平(50mg/L,250mg/L)的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基,放入5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)4~6周,觀察結(jié)果。4結(jié)果4.1dna的dna采用結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒方法提取32份痰涂片陽(yáng)性的DNA。以提取的DNA為模板,應(yīng)用序列特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,以1%瓊脂糖凝膠電泳,32個(gè)泳道在600~700bp處均可見(jiàn)條帶,條帶清晰明亮(見(jiàn)圖2)。4.2臨床菌株突變由RCA檢測(cè)結(jié)果(表3)說(shuō)明,32株臨床菌株共有24株突變,其中516G、526G、526C和531各占2、5、7、9株,另有516/526C聯(lián)合突變1株。4.3lrap關(guān)鍵因素對(duì)產(chǎn)品鑒定的影響對(duì)32份痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌rpoB基因PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行DNA單項(xiàng)測(cè)序,證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段均為580bp。序列結(jié)果與GenBank中所公布的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RVrpoB基因片段核苷酸序列進(jìn)行BLAST對(duì)比,其中8株菌株未發(fā)現(xiàn)突變,其余24株菌株中均發(fā)生突變,總突變率為87.5%,涉及4種突變類型(見(jiàn)表4);其中1株發(fā)生聯(lián)合突變。由測(cè)序結(jié)果可知,24株臨床結(jié)核分枝桿菌rpoB基因均有堿基突變,與RCA檢測(cè)結(jié)果一致。4.4抗結(jié)核藥物利福平敏感菌株對(duì)32株結(jié)核分支桿菌臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),結(jié)果顯示對(duì)抗結(jié)核藥物利福平敏感的菌株為8株,25%(8/32);耐藥菌株為24株,75%(24/32)。4.53分子質(zhì)量檢測(cè)(1)RCA結(jié)果,32株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中,24株為利福平耐藥菌株。與測(cè)序結(jié)果均一致,均發(fā)生在“RRDR”的81個(gè)堿基內(nèi)。其中23株單位點(diǎn)突變,516位2株,526位12株,531位9株,另有1株516和526雙位點(diǎn)突變。在我們所檢測(cè)的24株突變株中,單一位點(diǎn)突變的23株皆為錯(cuò)義突變,占所有突變株的95.8%。9例531位突變皆為TCG→TTG(Ser→Leu)。10例526位突變中,4例為CAC→CGC(His→Arg),2例CAC→CCC(His→Pro),2例子CAC→AAC(His→Asn),2例CAC→GAC(His→Asp),1例CAC→TAC(His→Tyr),1例CAC→CTC(His→Leu)。2例516位突變分別為GAC→GTC(Asp→Val)和GAC→TAC(Asp→Tyr)。1株兩位點(diǎn)聯(lián)合突變的菌株,為516位和526位的組合,其中516位的突變形式為GAC→TAC(Asp→Tyr),而526位的突變形式為CAC→CGC(His→Arg)。(2)DNA測(cè)序相比,RCA檢測(cè)初治和復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RIF耐藥的靈敏度和特異度達(dá)100%。(3)以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法為金標(biāo)準(zhǔn),與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比,RCA檢測(cè)初治和復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者RIF耐藥情況的檢測(cè)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),靈敏度和特異度分別為91.6%和75.0%,Kappa值為0.87,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為91.7%和75%(見(jiàn)表6)。5檢測(cè)結(jié)果基本見(jiàn)表1:本檢測(cè)方法的基本原理及與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)到痰標(biāo)本的檢測(cè)全球耐藥結(jié)核病形勢(shì)嚴(yán)峻,利福平耐藥在臨床的比例很高,而且是MDR-TB,XDR-TB的標(biāo)志,研究表明96%的利福平耐藥存在rpoB基因突變,雖然已經(jīng)發(fā)展很多分子生物學(xué)的診斷技術(shù),但臨床上大多仍然應(yīng)用絕對(duì)濃度法的表型測(cè)定,所以,建立和評(píng)價(jià)快速靈敏特異的耐藥監(jiān)測(cè)方法是應(yīng)對(duì)我國(guó)結(jié)核病高耐藥率流行亟需解決的問(wèn)題。本研究利用RCA技術(shù)直接用于痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌利福平藥物敏感性的檢測(cè),針對(duì)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)RRDR常見(jiàn)的突變位點(diǎn)及形式,設(shè)計(jì)并合成rpoB基因突變的六個(gè)探針進(jìn)行快速突變富集檢測(cè)。與DNA測(cè)序相比,RCA檢測(cè)初治和復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者利福平耐藥情況完全一致。與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比,本檢測(cè)方法檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為91.6%,75.0%,具有較好的真實(shí)性;本檢測(cè)方法檢測(cè)利福平耐藥的Kappa值為0.87。根據(jù)Kappa值判定標(biāo)準(zhǔn):κ≤0.40為一致性較差,0.40<κ≤0.60為中度一致,0.60<κ≤0.80為較高度的一致性,κ>0.80為極好的一致性,說(shuō)明RCA技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性的一致性很高,具有較高的可靠性。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法為金標(biāo)準(zhǔn),與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比,本檢測(cè)方法直接對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),而傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是基于改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn);與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)所需的2~3個(gè)月相比,本檢測(cè)方法幾個(gè)小時(shí)內(nèi)既可得到結(jié)果;且具有較高的靈敏度和較高的特異性。對(duì)32份痰標(biāo)本的RCA結(jié)果、DNA測(cè)序結(jié)果和藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行比較,28株結(jié)果均一致。另有藥敏試驗(yàn)為耐藥的菌株RCA結(jié)果敏感,DNA測(cè)序未見(jiàn)突變的菌株2株,這種情況有類似報(bào)道,且占到相當(dāng)?shù)谋壤?。原因可能是雖然目前已把rpoB突變作為結(jié)核分枝桿菌耐RIF的標(biāo)志,但rpoB突變并不能完全解釋結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制。目前尚有5%左右的耐RIF結(jié)核分枝桿菌未能在rpoB突變熱點(diǎn)區(qū)檢出突變。已檢測(cè)出的rpoB基因突變多達(dá)20余種,這些突變是否均能導(dǎo)致耐藥性還未能完全闡明。突變位點(diǎn)位于擴(kuò)增的629bp的rpoB基因片段檢測(cè)區(qū)之外,或還存在其他的耐藥機(jī)制:在rpoB核心突變區(qū)之外的位置發(fā)生突變;RNA聚合酶其它亞基的突變;影響RIF滲透性的細(xì)菌胞膜的改變等。同時(shí),由于引物設(shè)計(jì)只限于擴(kuò)增目前已知的突變的高發(fā)區(qū)域,因此也可能遺漏非高發(fā)區(qū)域的突變類型,有待在后續(xù)研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并增加針對(duì)其他位點(diǎn)的突變進(jìn)行檢測(cè)。另有2株菌株RCA結(jié)果與測(cè)序結(jié)果均為531位突變,而藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感,可能與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法臨界濃度的設(shè)定有關(guān)。本研究是應(yīng)用RCA方法對(duì)痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌利福平敏感性直接檢測(cè)的初步研究,還存在一些不足之處。首先,樣本量較小,還不足以進(jìn)行全面的分析;其次,本實(shí)驗(yàn)采用的滾環(huán)擴(kuò)增涉及了6種常見(jiàn)的突變類型探針,未能涵蓋rpoB基因擴(kuò)增范圍內(nèi)的其它類型突變,還需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步增加突變探針類型,如509位,510位,512位,513位,514位,515位,522位,533位等。在滾環(huán)擴(kuò)增中,擴(kuò)增結(jié)果與酶的選擇、溫度等條件密切相關(guān),因此還需進(jìn)一步