5種綿羊精液稀釋液在常溫條件下的緩釋效果

5種綿羊精液稀釋液在常溫條件下的緩釋效果

眾所周知，精子質(zhì)量是影響工藝精細(xì)效果的重要因素之一，而精細(xì)稀釋溶液的制備對生津溫度條件下的山羊精子質(zhì)量有直接影響。依據(jù)稀釋液組份不同，綿羊精液常溫保存稀釋液的配方有很多種。本試驗(yàn)通過對9種不同配方稀釋液常溫保存綿羊精液效果進(jìn)行試驗(yàn)觀察，最終篩選出效果較好的5種稀釋液配方，并將其在常溫條件下處理保存的綿羊精液用于適配母羊的人工授精，觀測其不返情率，進(jìn)一步比較在常溫條件下用上述不同配方稀釋液處理的綿羊精液的人工授精效果，旨在獲得對綿羊精液稀釋效果較好的常溫保存綿羊精液稀釋液配方，以便在廣大農(nóng)村推廣使用。1試驗(yàn)材料和方法1.1小尾寒羊羊種本試驗(yàn)選取北京市大興區(qū)四季興養(yǎng)殖中心的成年種公羊（2～3歲）5只，其中小尾寒羊公羊3只，無角陶賽特公羊1只，蒙古羊公羊1只，供采精用。試驗(yàn)所用母羊也為該中心飼養(yǎng)，品種為小尾寒羊。選擇達(dá)到適配年齡（2～3歲），經(jīng)產(chǎn)的發(fā)情母羊作為人工授精的對象，共30只。1.2假陰道內(nèi)的壓力和采精2004年3月15日-2004年5月19日。首先，對人工授精使用的器械進(jìn)行嚴(yán)格消毒。采精前公羊外陰部及周圍用0.1%高錳酸鉀溶液沖洗消毒，并用毛巾擦干。采精員身穿已消毒的工作服，洗凈手臂并消毒。其次，應(yīng)注意假陰道的正確使用。假陰道內(nèi)的溫度一般控制在38℃～40℃。假陰道內(nèi)的壓力可借助注水和吹入空氣來調(diào)節(jié)，以假陰道內(nèi)胎口處形成Y形，即呈現(xiàn)3個(gè)飽滿的瓣?duì)畋硎緣毫线m。其潤滑度可用消毒的潤滑劑（液體石蠟、凡士林）對假陰道內(nèi)表面加以潤滑，涂抹部位是假陰道全長的1/3～1/2處至開口外圍。采精用的臺畜一般為活畜，如發(fā)情母羊或去勢公羊等。經(jīng)過訓(xùn)練調(diào)教的公羊一到采精現(xiàn)場，不要急于讓其爬跨臺畜，應(yīng)適當(dāng)誘情，如繞臺畜轉(zhuǎn)幾圈等，讓公羊在采精前有充分的性準(zhǔn)備，可提高采得精液的質(zhì)量和數(shù)量。采精員位于臺畜右側(cè)，右手持假陰道與臺畜平行，假陰道開口應(yīng)和公羊陰莖伸出的方向傾斜度一致。在公羊爬跨臺畜向前做“沖躍”動(dòng)作時(shí)，采精員左手四指并攏握住包皮，將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)。待射精完畢，立即將集精杯一端豎直向上，先放去假陰道內(nèi)胎的空氣，然后取下集精杯，送往精液處理室做精液品質(zhì)檢查。公羊的采精頻率在配種季節(jié)每天采精1～2次，每周采精達(dá)5～10次。但每周應(yīng)讓其休息1～2d。1.4精子的密度和數(shù)量正常的精液應(yīng)為白色或淡黃色，無味或略帶腥味。凡呈紅褐色、綠色并有臭味的精液不能用于輸精,含有大塊凝固物質(zhì)的精液也不能使用。肉眼觀看剛采集的精液應(yīng)呈翻騰滾動(dòng)的云霧狀態(tài)。綿羊的射精量為0.5～2.0mL，一般為1mL左右。1mL綿羊精液中精子的數(shù)量約20～30億左右。檢查精子的密度，常用3級評定：密集的精子充滿顯微鏡整個(gè)視野，精子之間幾乎無空隙或空隙小于1個(gè)精子的長度，看不出單個(gè)精子活動(dòng)情況的為“密”；精子間相互距離有1～2個(gè)精子的長度，能看清單個(gè)精子活動(dòng)的為“中”；視野中只有少量精子，且相互距離很大的為“稀”。密度在中等以上的精液才能使用。1.5稀釋液的稀釋是采用液壓法見圖2。根據(jù)對于第1規(guī)定，把液配制到液最初收集到原始精液稀釋液配方共9種（見表1）。經(jīng)對綿羊精液稀釋后觀察其在常溫下的保存效果（精子總存活時(shí)間和精子有效存活時(shí)間），從中篩選出較好的5種稀釋液配方（見表2），并進(jìn)行綿羊精液稀釋保存后的母羊人工授精試驗(yàn)。稀釋液制作方法與精液稀釋比例如下：1號稀釋液：精液稀釋比例1∶4。2號稀釋液：精液稀釋比例1∶4,方法是：將新鮮雞蛋的蛋清用濾紙吸凈，除去卵黃膜，量取10mL卵黃與生理鹽水混勻，再加入適量抑菌藥物即可。3號稀釋液：精液稀釋比例1∶4，方法是：采集新鮮羊奶用7層紗布過濾2次，再將其煮沸10～15min，冷卻至常溫后去奶皮，再用生理鹽水稀釋混勻即可。4號稀釋液：精液稀釋比例1∶10，方法是：采集新鮮羊奶用7層紗布過濾2次，再將其煮沸10～15min，加入明膠攪拌至溶化混勻，冷卻至常溫后去奶皮，再加入抑菌藥物即可。5號稀釋液：精液稀釋比例1∶4，方法是：在雙蒸水中加入葡萄糖和檸檬酸鈉，過濾2～3遍，蒸煮30min，降溫至25℃，再加入新鮮卵黃和抑菌藥物，降至室溫即可。6號稀釋液：精液稀釋比例1∶10，方法是：將明膠加熱至液態(tài)再與雙蒸水混勻，加入抗菌藥物即可。7號稀釋液：精液稀釋比例1∶4，方法是：將蜂蜜溶入水中，加入抗菌藥即可。8號稀釋液：精液稀釋比例1∶4。9號稀釋液：精液稀釋比例1∶4。配制稀釋液原則上是現(xiàn)用現(xiàn)配。如隔日使用和短期保存（3～5d），必須嚴(yán)格滅菌、密封，放在0℃～5℃冰箱中保存。但卵黃、抗生素等物質(zhì)，必須在使用前添加。配制稀釋液用水應(yīng)為新鮮、無菌的蒸餾水或雙蒸水。藥品最好用分析純，稱量藥品必須準(zhǔn)確，充分溶解，過濾，消毒。精液采回后，在37℃等溫條件下，按上述稀釋比例做精液原液稀釋，然后裝入洗凈的青霉素小瓶中編號標(biāo)記。當(dāng)精液稀釋后自然降至室溫時(shí)（約12℃～15℃左右），置于12℃～15℃恒溫冰箱中保存。每隔2～4h翻動(dòng)1次青霉素小瓶，以防止精液發(fā)生沉淀和發(fā)生精子凝集現(xiàn)象。1.7活動(dòng)精子的保存時(shí)間剛開始精子活力較好時(shí)，每隔4h檢查1次，隨著精子活力下降到0.3以下后，1h鏡檢1次。即鏡檢時(shí)有活動(dòng)精子的總計(jì)保存時(shí)間。即鏡檢時(shí)精子活力為0.3以上的保存時(shí)間。1.8輸精量的確定綿羊在發(fā)情開始后10～36h內(nèi)輸精為宜。我們根據(jù)公羊試情情況，在母羊發(fā)情開始后早晚各輸精1次。次日仍然發(fā)情的母羊，進(jìn)行第3次輸精。稀釋精液的用量為0.20～0.30mL。精子活力為0.3以上。母羊的輸精部位在子宮頸口或插入子宮頸1cm左右。1.9母羊無返情情況將我們篩選出的A、B、C、D、E共5種稀釋液，隨機(jī)采取公羊精液后在常溫下進(jìn)行稀釋處理。稀釋保存后的5種精液（活力在0.3以上）各隨機(jī)用于6只發(fā)情待配母羊人工輸精，共輸精30只種母羊。人工輸精（18～21d）后，觀察記錄母羊未返情個(gè)體。若未返情，則作為判斷母羊已經(jīng)妊娠的依據(jù)，通過未返情率推算母羊受胎率。人工授精后統(tǒng)計(jì)A、B、C、D、E5種稀釋液處理的綿羊精液的人工輸精母羊未返情母羊只數(shù)及未返情率，并將A、B、C、D、E5種稀釋液處理的綿羊精液人工授精后母羊未返情率進(jìn)行樣本百分?jǐn)?shù)差異顯著性檢驗(yàn)。2試驗(yàn)結(jié)果2.1稀釋液的配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果將原始9種稀釋液隨機(jī)分成3組，每種稀釋液做4次羊精液稀釋保存試驗(yàn)，羊精液稀釋后常溫保存精子存活時(shí)間為4次試驗(yàn)平均值，結(jié)果見表3。從表3可知2、3、5、7、8、9號等共6種稀釋液配方效果較好。但是，考慮到所用藥品的應(yīng)用廣泛性、成本、配制的繁鎖性，我們剔除8、9號稀釋液。又因?yàn)檫@次試驗(yàn)的主要目的是為廣大的中小型企業(yè)選擇適用的精液稀釋液，所以我們考慮到養(yǎng)殖場人工投入、技術(shù)支持、設(shè)備成本的問題，保留了1號稀釋液配方。2.2加入適量抑菌素類藥物我們主要針對以上篩選出來的5種稀釋液保存精液總存活時(shí)間較短問題，分別加入適量抑菌素類藥物，進(jìn)一步改進(jìn)其保存精液能力，再重復(fù)上面的試驗(yàn)，并記錄試驗(yàn)結(jié)果，見表4。我們可以從表4中看出，在我們改進(jìn)了這5種原始配方后，其精液保存效果都有了一定的提高，從而反映出抑菌素的添加是很有必要的。2.3稀釋液稀釋使用試驗(yàn)結(jié)果將篩選出來的1、2、3、5、7號稀釋液重新編號為A、B、C、D、E后，進(jìn)行綿羊精液稀釋保存和母羊人工授精試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。經(jīng)過A、B、C、D、E5種稀釋液配方稀釋保存羊精液的人工授精母羊的觀察，母羊未返情率分別為66.67%、83.33%、66.67%、83.33%、83.33%，人工授精效果較好。經(jīng)未返情率的樣本百分?jǐn)?shù)差異顯著性檢驗(yàn)，5種稀釋液配方稀釋保存羊精液的人工授精母羊未返情率之間差異不顯著（P>0.05）。3人工輸精性的影響我們篩選出來的5種稀釋液配方最大的特點(diǎn)就在于成本低廉，配制工序簡便，組成成分來源廣泛充足。在一般小型養(yǎng)殖場內(nèi)，采集來的綿羊精液一般是現(xiàn)采現(xiàn)用，或僅保存很短時(shí)間（約1～2d左右）。所以，我們篩選出的稀釋液配方雖然在常溫條件下稀釋保存羊精液的精子有效存活時(shí)間（h）和總存活時(shí)間（h）不是很長，但試驗(yàn)結(jié)果表明，如果在1天之內(nèi)輸精或是精液品質(zhì)很好的情況下（活力0.3以上）使用我們篩選出來的稀釋液處理羊精液，其羊的人工輸精效果還是較好的，是可以作為基層養(yǎng)殖場推廣使用的。并且，對于這些小規(guī)模養(yǎng)殖場來說，使用我們提供的自配精液稀釋液，可以節(jié)約一些開支。本試驗(yàn)中，溫度是影響精液保存效果的關(guān)鍵因素之一。稀釋應(yīng)等溫，以防止低溫打擊。精液稀釋后不能馬上放入恒溫冰箱，應(yīng)從38℃緩緩降至室溫。保存精液的恒溫冰箱溫度應(yīng)在12℃～15℃之間。溫度過低，精子因不能耐受而死亡；溫度過高，精子的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，但存活的時(shí)間縮短。常溫保存時(shí)，精子在兩小時(shí)后進(jìn)入休眠狀態(tài)，代謝減緩，這樣就使其延長了存活時(shí)間。放入恒溫冰箱之后，還要經(jīng)常翻動(dòng)裝精液的小瓶，使沉淀的物質(zhì)盡量溶于稀釋液中，防止代謝廢物聚集而對精子產(chǎn)生毒害作用。但是在實(shí)際操作中，我們放入恒溫冰箱的稀釋精液降至室溫的速度過快，而且翻動(dòng)裝精液的小瓶的頻率不夠均勻（白天翻動(dòng)多，夜間翻動(dòng)少），影響了精液的保存效果。鏡檢精子活力時(shí)精液瓶每天被數(shù)次拿進(jìn)拿出恒溫冰箱，導(dǎo)致精液溫度波動(dòng)很大，這對精子的傷害是不可忽視的。所以，本試驗(yàn)中的精液保存應(yīng)該可以有更好的效果。此外，本次試驗(yàn)樣本較少，使試驗(yàn)誤差的影響增大，造成篩選的稀釋液配方準(zhǔn)確度降低，但限于條件和時(shí)間有限，重復(fù)試驗(yàn)的次數(shù)無法再增加。保存精液的恒溫冰箱是場內(nèi)食堂提供的，所以除我們?nèi)幼鲇^察時(shí)使用外，冰箱也時(shí)常被場內(nèi)工作人員打開使用，這使冰箱內(nèi)溫度波動(dòng)很大，不恒定，對精子也造成了一定傷害。4精母羊返情率低，材料費(fèi)用少通過本次試驗(yàn)，我們所篩選出的5種綿羊精液稀釋液配方配制方法簡單，成分藥品容易買到，藥品成本比較低廉，精液保存效果較好，人工授精