植物與微生物的相互作用

植物與微生物的相互作用一、共生菌與病原菌的應(yīng)用1.1利用工程化的共生菌保護植物免受凍害

定植于植物葉面的丁香假單胞菌在細胞表面產(chǎn)生一種冰成核蛋白（icenucleationprotein），在稍低于0℃以下的條件下，這種蛋白引起結(jié)冰，使作物遭受凍害，StevenLindow及其研究小組利用DNA重組技術(shù)及同源重組技術(shù)得到Ice-突變株，使結(jié)冰溫度下降到-9℃。1.2利用固氮菌提高作物產(chǎn)量化學固氮轉(zhuǎn)化條件苛刻：溫度高于500℃，壓力大于200atm。大量施入田間的肥料流失，最終流入海洋，導(dǎo)致水體嚴重污染以及水中微藻及其它微生物大量繁殖。生物固氮無需消耗燃料或電等能源，不造成污染，過程復(fù)雜，需要酶（固氮酶和固氮酶的還原酶）的參與，消耗大量ATP，需要嚴格無氧的微環(huán)境。二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因方法植物轉(zhuǎn)基因方法分為兩類：一是直接基因轉(zhuǎn)移方法:基因槍法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。二是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化?；驑尫▋?yōu)點：不受物種的限制只要構(gòu)建基因表達盒（啟動子-基因-終止子），不需要構(gòu)建在表達載體上沒有農(nóng)桿菌污染可以快速知道基因表達（瞬時表達，研究啟動子功能）缺點：1價格貴2基因往往多拷貝插入原生質(zhì)體轉(zhuǎn)基因優(yōu)點：不受物種的限制只要構(gòu)建基因表達盒，不需要構(gòu)建在表達載體上沒有農(nóng)桿菌污染可以研究基因瞬時表達缺點：操作比較麻煩、難度大（原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化、再生）ProtoplasttransformationoftransgenicValenciasweetorangeplantswithGFPbyPEG-mediation一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的（Agrobacterium-mediated）轉(zhuǎn)基因機理土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium

tumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，在自然界中普遍存在，其特點是能感染雙子葉植物，并引起植物形成腫瘤。天然的植物遺傳工程土壤農(nóng)桿菌的基因組與Ti質(zhì)粒組成原因：土壤農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上一段DNA（T-DNA，transferDNA，編碼生物堿和植物激素）轉(zhuǎn)到了植物細胞基因組中，引起植物細胞旺盛分裂。（一）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)毒性區(qū)腫瘤區(qū)冠癭堿代謝區(qū)復(fù)制區(qū)

Ti質(zhì)粒大約在160-240kb之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（regionencodingconjugation)和ori區(qū)（originofreplication)。auxA

auxB

cyt

ocsLBRBLB,RB–leftandrightborders(directrepeat)auxA+auxB–enzymesthatproduceauxincyt–enzymethatproducescytokininOcs–octopine

synthase,producesoctopine

1.T-DNA的結(jié)構(gòu)

T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界。左邊界（leftborder）和右邊界（rightborder）：是長為25bp的末端重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。生長素合成酶基因（tms）：由2個基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）；細胞分裂素合成酶基因tmr：由1個基因組成：ipt

冠癭堿合成酶基因tmt：冠癭堿是含稀有氨基酸衍生物，稱為opines，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine）。被感染的植物誘導(dǎo)合成這些有機堿，但植物不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌作為氮源及碳源使用。根據(jù)冠癭堿不同，Tiplasmids可以為幾種：1)胭脂堿型（Nopalineplasmids）:帶有在植物中合成胭脂堿的基因和在細菌中代謝、利用胭脂堿的基因。形成的腫瘤可以分化出不定芽。Nos啟動子，Nos終止子。2)章魚堿（Octopineplasmids）:帶有在植物中合成章魚堿的基因和在細菌中代謝、利用章魚堿的基因。形成的腫瘤不能分化，成為愈傷組織。3)農(nóng)桿堿型（Agropineplasmids）:帶有在植物中合成農(nóng)桿堿的基因和在細菌中代謝、利用農(nóng)桿堿的基因。形成的腫瘤不分化，生長遲緩，死亡早。4)發(fā)根型（Riplasmids）:誘導(dǎo)毛狀根或者腫瘤。2.Vir(virulent)genes（毒性基因區(qū)，致病基因區(qū)About30kb;virA,B,C,D,E,F,G(A-Eareoperonswith multipleORFs)；受到受傷植物細胞釋放的Acetosyringone

(AS，乙酰丁香酮)

激活；把Ti-質(zhì)?；蛘逺i-質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞基因組中（轉(zhuǎn)基因）。virA

-transportsASintobacterium,activates virG；virG

-promotestranscriptionofothervirgenes；virD2-endonucleasethatcutsT-DNAatthe bordersbutonlyononestrand;attachesto the5‘endoftheSSofT-DNA；virE2-DNA-bindingprotein,bindsSSofT- DNA；virD2&virE2alsohelpT-DNAgettonucleusinplantcell,theyhaveNLSs(核定位信號)；virB

-11ORFs,helpsDNA-proteincomplex getthroughcellmembranes。（二）T-DNA的整合機制

T-DNA的詳細整合機制尚不完全清楚，明確的：農(nóng)桿菌染色體上的基因（chvA,chvB,pscA等）決定與植物細胞的附著；植物損傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上Vir（Virulenceregion)基因的表達；Vir區(qū)編碼的基因產(chǎn)物分別在LB和RB的第三個堿基和第四個堿基之間產(chǎn)生缺口，形成單鏈T-DNA，并將其運到植物細胞核中，整合到核基因組中。由特異性內(nèi)切酶完成。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關(guān)，而LB無關(guān)。T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列。植物腫瘤二、植物基因表達載體天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達載體使用：

a.被轉(zhuǎn)化的植物細胞產(chǎn)生大量的生長素和細胞分裂素，導(dǎo)致腫瘤的形成，阻止了細胞再生長為整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因。

b.冠癭堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無關(guān)，而且可能會影響植物細胞生長，因為冠癭堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除冠癭堿合成基因（tmt）

c.Ti質(zhì)粒約為200kb，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點。

d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制，為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴增，須添加入大腸桿菌復(fù)制子。植物細胞中一般不存在質(zhì)粒，為利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了共整合系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，避免了在大的Ti質(zhì)粒上進行分子重組操作的困難。1.植物細胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)

T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kan+。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上，Kan+篩選轉(zhuǎn)化細胞。共整合載體

大腸桿菌質(zhì)粒農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒重組農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒2.植物細胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng)

目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞的標準方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細胞中。雙元載體系統(tǒng)目的基因表達盒tgacaggatatattggcgggtaaacRBtggcaggatatattgtggtgtaaacaLB多克隆位點報告基因植物篩選基因Kpn

IXba

I啟動子基因終止子三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因步驟農(nóng)桿菌準備：單菌落、試管中培養(yǎng)，再在三角瓶中放大培養(yǎng)（1：30-50稀釋）至OD600=0.5-1。在培養(yǎng)結(jié)束前1h加20-100μMAS可以促進農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。4000-5000rpm/4℃離心收集，再用植物培養(yǎng)基懸浮，備用。植物材料的準備：要求生長健壯、再生能力強、無菌；切成小片（小段）。感染：將農(nóng)桿菌液與植物材料混合，浸潤10-30min。共培養(yǎng)：植物材料在無菌吸水紙上吸干農(nóng)桿菌液后，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)基上（共培養(yǎng)基常常含有AS），培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)基因在此時間內(nèi)完成。篩選與再生：共培養(yǎng)結(jié)束后的植物材料轉(zhuǎn)到選擇與再生培養(yǎng)基上（含2種抗生素，分別抑制農(nóng)桿菌和非轉(zhuǎn)基因植物細胞生長）。轉(zhuǎn)基因植物的鑒定與評價：報告基因、PCR、Southernblot、Northernblot、產(chǎn)物分析等。圖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞感染轉(zhuǎn)化選擇轉(zhuǎn)基因植株評價與鑒定再生轉(zhuǎn)基因植物的鑒定：（1）檢測報告基因:GUS（編碼葡萄糖苷酶）報告基因檢測（GUS染色）GUS染色原理5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷，無色蘭色分析啟動子功能GFP:greenfluorescentprotein。是從維多利亞水母(Aequorea

victoria)中分離出來的，受紫外線激發(fā)而發(fā)出綠色熒光GFP基因（2）PCR檢測植物基因組中外源DNA（目的基因、啟動子）（可能有假陽性）（3）Southernblot直接檢測植物基因組中外源DNA（目的基因、啟動子）鑒定轉(zhuǎn)基因最直接的證據(jù)。發(fā)表文章時必須提供該證據(jù)基因組DNA、酶切、電泳、轉(zhuǎn)移DNA到雜交膜、與探針雜交、洗脫、檢測（放射法、化學法）、照相（4）檢測外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)物

RT-PCR

WesternBlot基因表達載體的構(gòu)建：目的基因和啟動子的選擇與獲得、表達載體的構(gòu)建（DNA重組）與確認。基因工程菌的獲得：將基因表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，并選出含有基因表達載體的菌落。建立被改良植物的高效再生體系：不定芽再生體系、胚狀體再生體系、原球莖再生體系（蘭花）。確定植物材料對抗生素（潮霉素、卡那霉素）的敏感濃度：臨界敏感濃度轉(zhuǎn)基因效率的提高方法：四、怎樣建立植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實例:火焰衛(wèi)矛（Euonymusalata

）轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究秋天，綠葉轉(zhuǎn)紅，形成霜葉紅于二月花的景象

140年:廣為栽培、選育新品種；重要的園藝觀賞植物，年產(chǎn)值2-3億美元。問題：結(jié)實旺盛，擴散到野外繁殖、形成優(yōu)勢種群，抑制本地植物生長、破壞生物多樣性。方法：禁止種植（問帶來題：無替代植物，影響公司產(chǎn)業(yè)、影響就業(yè)）培育無籽品種：好(1)研究植株再生技術(shù)不定芽的誘導(dǎo)最佳條件研究生根最佳條件研究(2)選擇抗性試驗(3)構(gòu)建“超級不育”表達載體pAB5啟動子花粉與胚囊特異Barnase基因RNA酶Agl5啟動子子房特異iaaM基因合成生長素雌雄不育無籽結(jié)實無籽果實(4)轉(zhuǎn)基因植株培育(5)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定轉(zhuǎn)基因植株的報告基因（GUS）表達驗證X-Gluc（無色）GUS

蘭色Gusplus基因在原核生物中不表達五、影響轉(zhuǎn)基因效率的因素什么是轉(zhuǎn)基因效率？愈傷組織水平：轉(zhuǎn)基因效率=芽的水平：轉(zhuǎn)基因效率=植株水平（最重要）轉(zhuǎn)基因效率=轉(zhuǎn)基因愈傷組織的總數(shù)感染的外植體總數(shù)X100%轉(zhuǎn)基因芽的總數(shù)感染的外植體總數(shù)X100%轉(zhuǎn)基因植株的總數(shù)感染的外植體總數(shù)X100%一個轉(zhuǎn)基因方法好不好，可以用轉(zhuǎn)基因效率衡量1.植物的再生方法與效率影響植物再生效率的因素必然影響轉(zhuǎn)基因效率。植物的再