基于玻碳電極的甲胎蛋白安培免疫傳感器的研究

基于玻碳電極的甲胎蛋白安培免疫傳感器的研究

甲基苯丙胺是一種由590個氨基酸組成的單鏈糖蛋白。主要存在于肝腫瘤、尿黃囊腫和其他腫瘤患者的血清中。正常成人血清中AFP含量很少,高于20ng/ml就有肝腫瘤的可能,因此,痕量檢測AFP具有重要意義。目前報道的AFP檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、表面等離子體諧振(SPR)、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、放射免疫和時間分辨熒光免疫分析法。然而這些方法具有放射危害、耗時長、人員要求高、需要昂貴儀器等缺點。電化學(xué)免疫傳感器由于具有操作簡單快捷、靈敏度高、特異性好、價格低廉等優(yōu)點成為甲胎蛋白等腫瘤標(biāo)志物新的檢測方法。應(yīng)用納米材料修飾電極可以提供傳感器的靈敏度,目前文獻報道的納米修飾材料有碳納米球、二氧化硅、納米Pt、二氧化錳、石墨烯、碳納米管(CNTs)、納米金(nano-Au)等。其中CNTs由于具有良好的力學(xué)和電學(xué)性質(zhì)倍受青睞;nano-Au由于其良好的生物相容性而廣泛用于抗體或抗原的固定修飾。本研究在碳納米管修飾的玻碳電極上,利用表面帶正電荷的硫堇與帶負電荷DNA直接的靜電作用,利用層層自組裝技術(shù)多層修飾硫堇以增強檢測信號,同時利用納米金固定甲胎蛋白抗體,制備了無酶型新型甲胎蛋白安培免疫傳感器,為甲胎蛋白的痕量檢測提出了新的方法。1材料和方法1.1甲胎蛋白及培養(yǎng)基抗體檢測CHI842C電化學(xué)工作站(上海辰華公司);三電極體系:鉑電極為對電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極;多層碳納米管(CNTs)購自中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司;甲胎蛋白單克隆抗體及甲胎蛋白購自鄭州博賽生物公司;硫堇、檸檬酸三鈉、氯金酸、N,N-二甲基甲酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)均購自上海國藥試劑;牛血清白蛋白、小牛胸腺DNA購自美國Sigma公司;其余試劑均為分析純。緩沖液(PBS)為0.1mol/LKH2PO4配置,用NaOH調(diào)節(jié)不同pH值。1.2方法1.2.1納米金的合成參考文獻:0.45×10-3mol/L檸檬酸鈉溶液加入煮沸的0.25×10-3mol/LHauCl4溶液中,劇烈攪拌,約10min后變成酒紅色,表示納米金合成,持續(xù)攪拌30min,冷卻后備用。1.2.2修飾電極的制備將直徑為3mm玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05μmAl2O3在拋光布上打磨,然后依次用乙醇和超純水超聲清洗(每次清洗3～5min),這樣就可得到一個平滑光潔新鮮的電極表面。電極修飾過程如圖1:(1)5μlCNTs(2mg/ml)滴加在玻碳電極表面,自然干燥;得到碳納米管修飾電極(CNTs/GCE),(2)電極浸泡在(0.2mmol/L)EDC/(0.1mmol/L)NHS2h后取出;(3)迅速將其浸入3mmol/L的硫堇溶液中3h,超純水清洗;(4)電極干燥后,10μlDNA(10mg/ml)滴在電極表面,4℃冰箱作用4h;水洗,干燥;重復(fù)步驟(3)、(4),直至硫堇氧化還原峰電流達到最大值;(5)電極浸入上述制備的金膠溶液中,過夜,超純水洗滌,干燥;(6)電極浸入抗甲胎蛋白抗體溶液中,4℃冰箱過夜孵育,洗滌,最后用BSA室溫孵育40min,封閉未結(jié)合位點。制備的電極放4℃冰箱保存。1.2.3電化學(xué)檢測將制備的電極插入標(biāo)準品或病人血清中,室溫反應(yīng)后取出,用PBS輕輕洗滌,除去非特異性結(jié)合甲胎蛋白,然后將電極放在盛有PBS的反應(yīng)池中,在CHI842C電化學(xué)工作站上檢測。2結(jié)果2.1電極表面氧化還原信號通過循環(huán)伏安法表征了不同階段修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)(圖2A),在pH7.0的PBS中,與裸電極(a)相比,碳納米管修飾電極(b)背景電流顯著增加,說明碳納米管能夠增加電極有效面積,增加導(dǎo)電性。圖2B顯示的是電極層層修飾硫堇過程(1～5層),可以看出,通過層層自組裝技術(shù)修飾硫堇后,隨著層數(shù)的增加,電極表面氧化還原信號不斷增加。在第5層信號達最大值。電極表面修飾硫堇后(圖2A,c),硫堇分子的氨基可以進一步固定納米金原子,由于納米金可以促進電極表面的電子傳遞,電極表面氧化還原信號進一步上升(圖2A,d);電極表面吸附甲胎蛋白單克隆抗體后,由于抗體阻礙電極表面的電子傳遞,電極表面信號下降(圖2A,e);用BSA封閉電極表面剩余活性位點后(圖2A,f),電極表面信號進一步下降。圖3顯示的是制備電極在0.1mol/LPBS溶液中在不同掃速下(有內(nèi)至外):10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、500mV/s伏案特性曲線,內(nèi)插圖為掃速與峰電流線性關(guān)系。從圖3可以看出,陽極峰和陰極峰電流均隨掃速增加而成線性增加,即電極表現(xiàn)出明顯的表面控制過程。2.2免疫反應(yīng)最佳ph的測定免疫分析結(jié)果主要受緩沖溶液pH值、溫育時間等條件影響。如圖4A,在pH小于7.0時,免疫反應(yīng)信號隨pH增大而增大,在pH大于7.0時,免疫反應(yīng)信號隨pH增大而減小,故pH7.0是免疫反應(yīng)的最佳pH值;圖4B顯示的免疫反應(yīng)信號隨反應(yīng)時間增加而改變情況,在反應(yīng)時間達25min時,信號趨于穩(wěn)定,考慮節(jié)約檢測時間因素,選擇25min作為傳感器最佳檢測時間。2.3胎蛋白的檢測在優(yōu)化的條件下,制備的新型甲胎蛋白安培免疫傳感器對甲胎蛋白的檢測顯示:在0.5～25ng范圍內(nèi),傳感器還原峰電流與甲胎蛋白濃度對數(shù)值成正比,檢測限達0.02ng/ml。線性相關(guān)系數(shù)r=0.995(圖5)。2.4方法的精密度取不同時間、不同批次制備的免疫傳感器,對2ng/ml和10ng/mlAFP重復(fù)檢測3次,獲得的組內(nèi)相對標(biāo)準偏差為3.2%和4.5%,說明其具有良好的精密度。血清中主要的干擾物是具有電活性的物質(zhì),如離子、多巴胺、L-半胱氨酸、尿酸等,研究表明10～100倍以上上述干擾物濃度對檢測無影響,說明傳感器的抗干擾能力強。3甲胎蛋白的檢測方法腫瘤標(biāo)志物是癌細胞產(chǎn)生和釋放的某些物質(zhì),常以抗原、酶、激素、代謝產(chǎn)物的形式存在于腫瘤細胞內(nèi)或宿主體液中,根據(jù)其生化或免疫特性可以識別或診斷腫瘤。理想的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)具有高特異性,適于人群普查。腫瘤標(biāo)志物的血清學(xué)篩查可以簡便地診斷癌癥。就原發(fā)性肝癌而言,甲胎蛋白仍是特異性最強的標(biāo)志物和診斷肝癌的主要指標(biāo)?，F(xiàn)已經(jīng)廣泛用于肝細胞癌的普查、診斷和判斷治療效果、預(yù)測復(fù)發(fā)。目前,臨床上常規(guī)的甲胎蛋白檢測方法主要有ELISA、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光法等。ELISA雖然成本較低,可對人群進行大規(guī)模篩查和普查,但是耗時較長(大于1h),無法做到快速診斷和床旁診斷;化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光法需要昂貴的發(fā)光試劑和檢測儀器,檢測成本較高,不利于人群普查。電化學(xué)免疫傳感器由于具有操作簡單快捷、靈敏度高、特異性好、價格低廉等優(yōu)點成為檢測甲胎蛋白等腫瘤標(biāo)志物極具潛力的新方法。本實驗采用層層自組裝技術(shù)在多層碳納米管修飾的玻碳電極表面修飾了多層硫堇,進而利用硫堇分子表面的氨基固定納米金原子,以此來固定抗甲胎蛋白單克隆抗體,從而制備了可以實現(xiàn)對甲胎蛋白快速檢測的新型安培免疫傳感器。該傳感器在