海洋芽孢桿菌b-1047可濕性乳化劑的制備及應(yīng)用

海洋芽孢桿菌b-1047可濕性乳化劑的制備及應(yīng)用

可濕性粉（wp）是主要的微生物洗滌劑劑之一。潤(rùn)濕性（潤(rùn)濕時(shí)間）和懸浮率是評(píng)價(jià)農(nóng)藥可濕性粉的質(zhì)量的重要指標(biāo)，它直接影響到實(shí)際田藥的混合舒適度和均勻性。在可濕性粉劑加工過(guò)程中,粉碎和添加助劑是提高潤(rùn)濕性和懸浮率最常用的方法。已有研究報(bào)道,通過(guò)氣流粉碎和添加表面活性劑能提高多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的懸浮率和潤(rùn)濕性［1］,而加入吐溫-20可明顯縮短蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑的潤(rùn)濕時(shí)間［2］。但由于粉碎是高耗能過(guò)程,與單純添加助劑相比其增加了生產(chǎn)成本。因此,篩選合適的助劑是農(nóng)藥可濕性粉劑開發(fā)過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)。目前針對(duì)農(nóng)藥可濕性粉劑配方的研究多為宏觀的、經(jīng)驗(yàn)式的篩選［3］,由于缺乏系統(tǒng)的理論指導(dǎo)和科學(xué)的選擇方法,導(dǎo)致其在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中易出現(xiàn)懸浮率低、潤(rùn)濕性差和pH值較高等問(wèn)題?；炝显O(shè)計(jì)(mixturedesign)是較為合適的研究固體制劑中各成分最佳比例的方法［4］,已廣泛用于食品［5–7］、醫(yī)藥［8–10］及化學(xué)材料［11–13］等的配方優(yōu)化研究,但將該方法用于農(nóng)藥可濕性粉劑配方優(yōu)化的研究較少。劉振華［14］曾利用混料設(shè)計(jì)方法對(duì)多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑配方進(jìn)行過(guò)初步優(yōu)化。筆者所在實(shí)驗(yàn)室與上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司合作,成功創(chuàng)制出了首個(gè)海洋微生物農(nóng)藥———以海洋芽孢桿菌B-9987為活性成分、濃度為1.0×109CFU/g的海洋芽孢桿菌可濕性粉劑(WP)［14］。田間試驗(yàn)結(jié)果表明,其對(duì)番茄青枯病、甜瓜枯萎病和辣椒疫病等土傳病害均有較好的防治效果［15］。但是,利用海洋芽孢桿菌發(fā)酵液與載體直接混合、經(jīng)噴霧干燥后制備的可濕性粉劑,其懸浮率和潤(rùn)濕性均達(dá)不到農(nóng)藥可濕性粉劑標(biāo)準(zhǔn)(懸浮率≥70%,潤(rùn)濕時(shí)間≤120s)［14］的要求,而且制劑的pH值較高(≥8.70)。此外,由于海洋芽孢桿菌可濕性粉劑屬活體微生物農(nóng)藥,與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的經(jīng)驗(yàn)加工方式也存在較大差異。這些因素在很大程度上限制了海洋芽孢桿菌可濕性粉劑的推廣使用。本研究首先通過(guò)助劑篩選,選取與海洋芽孢桿菌具有較高生物相容性并能顯著提高制劑懸浮率和濕潤(rùn)性的助劑,然后利用混料設(shè)計(jì)確定最佳的固體介質(zhì)配方組合,并就該配方進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn),得到了懸浮率、潤(rùn)濕性及pH值符合農(nóng)藥可濕性粉劑標(biāo)準(zhǔn)要求的海洋芽孢桿菌可濕性粉劑。旨在為海洋芽孢桿菌可濕性粉劑配方的進(jìn)一步優(yōu)化奠定基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)其他可濕性粉劑的配方優(yōu)化提供參考。1材料和方法1.1發(fā)酵液、載體菌株:海洋芽孢桿菌B-9987(簡(jiǎn)稱B-9987,由華東理工大學(xué)海洋生化工程研究室保藏)。培養(yǎng)基:種子及發(fā)酵培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)方法［16］配制。發(fā)酵液:芽胞率≥95.00%(由華東理工大學(xué)海洋生化工程研究室制備)。載體:輕質(zhì)碳酸鈣(粒徑10μm,1250目),高嶺土(粒徑10μm,1250目)。助劑:烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽(MorwetD-425)(Akzonobel公司),丁基萘磺酸鈉(BX)及木質(zhì)素磺酸鈉(新沂市飛皇化工有限公司),亞甲基二萘磺酸鈉(NNO)及十二烷基硫酸鈉(SDS)(上虞浙創(chuàng)化工有限公司)。1.2熱壓培養(yǎng)箱、熱壓箱、背景箱SY6000噴霧干燥儀(水分蒸發(fā)量1kg/h,上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備有限公司);PYX-DHS-40X50-S隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);Delta320酸度計(jì)(上海梅特勒-托利多有限公司);恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)等。1.3測(cè)試方法按照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分別測(cè)定B-9987WP的pH值［17］、懸浮率［18］及潤(rùn)濕性(潤(rùn)濕時(shí)間)［19］。1.3.2b-19987hpa檢測(cè)采用平板培養(yǎng)法［20］,將供試助劑用純水配成1.00g/L的母液,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后,分別加入到50℃左右的液態(tài)培養(yǎng)基中,冷卻后制得固體平板,其中各助劑的質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.05和0.1g/L。接入同一批次制備的B-9987WP樣品,培養(yǎng)24h后考察其菌落數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)(1)式計(jì)算菌株存活率(SC)。式中:M表示含助劑平板上的菌落數(shù)(CFU/g);M0表示未添加任何助劑平板上的菌落數(shù)(CFU/g),即空白對(duì)照。1.3.3可濕性助劑的制備將木質(zhì)素磺酸鈉和SDS分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%的比例與輕質(zhì)碳酸鈣載體混合,用玻璃棒將混合物與B-9987發(fā)酵液攪拌均勻,再利用恒溫磁力攪拌器攪拌30min,之后邊攪拌邊通過(guò)噴霧干燥法制得可濕性粉劑。按1.3.1節(jié)方法測(cè)定懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間。1.3.4數(shù)據(jù)分析及結(jié)果采用Minitab16軟件對(duì)混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中,某一組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值=該組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(輕質(zhì)碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)+高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)+SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù))。2結(jié)果與分析2.1可濕性助劑的篩選盡管助劑對(duì)改善農(nóng)藥可濕性粉劑的懸浮率和潤(rùn)濕性等物理性狀很重要［14］,但對(duì)于以活菌為活性成分的微生物農(nóng)藥而言,其首要考慮因素應(yīng)是助劑與活菌的生物相容性,因?yàn)槟承┲鷦┛赡苡捎趯?duì)活菌的抑制作用較大而完全不能使用［20，23–25］。筆者在已有研究［14，26］的基礎(chǔ)上,選擇目前常用的幾種可濕性粉劑助劑:MorwetD-425、BX、NNO、木質(zhì)素磺酸鈉及SDS,考察了不同助劑與海洋芽孢桿菌B-9987的生物相容性。從圖1中可看出,MorwetD-425與B-9987的生物相容性較差,其明顯抑制了B-9987的生長(zhǎng),因此不適于作為B-9987WP的助劑;同樣,隨BX及NNO添加濃度的提高,B-9987的存活率均明顯下降,也表現(xiàn)為一定的抑制作用;而木質(zhì)素磺酸鈉和SDS與B-9987的生物相容性良好,兩者對(duì)活菌數(shù)影響不大,可作為進(jìn)一步考察的對(duì)象。2.2sds添加量對(duì)制劑懸浮率及潤(rùn)濕性的影響表1結(jié)果表明:雖然木質(zhì)素磺酸鈉也能顯著提高可濕性粉劑的懸浮率,降低制劑的潤(rùn)濕時(shí)間,但與SDS相比,其提高幅度較小。當(dāng)助劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0~10%范圍內(nèi)時(shí),隨著SDS添加量的增加,其提高制劑懸浮率及潤(rùn)濕性的效果更為明顯;但當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí),制劑懸浮率為69.86%,略低于可濕性粉劑標(biāo)準(zhǔn)(懸浮率≥70%)的要求,表明其最低添加量應(yīng)為5%;而當(dāng)其添加量超過(guò)10%后,制劑懸浮率再無(wú)明顯增加。因此,可選擇SDS作為B-9987WP的助劑,且其用量在5%~10%之間為宜。2.3混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)選擇pH值較低的高嶺土及懸浮率較好的輕質(zhì)碳酸鈣為載體,以可提高潤(rùn)濕性和懸浮率的SDS為助劑進(jìn)行了混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)。根據(jù)Minitab軟件的極端頂點(diǎn)設(shè)計(jì)方法,混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及所得各可濕性粉劑的潤(rùn)濕時(shí)間、pH值和懸浮率見表2。利用Minitab軟件等值線圖對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行分析,以確定最優(yōu)配方。2.3.1微型tab軟件等值線程分析的結(jié)果2.3.1.混料回歸模型由圖2中可看出,只有當(dāng)載體輕質(zhì)碳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在85%以上(區(qū)域4)時(shí),才能保證制劑的潤(rùn)濕時(shí)間在120s以內(nèi);同時(shí)只有提高SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)到9.5%以上時(shí),潤(rùn)濕時(shí)間才有可能低于90s(區(qū)域5)。表明以輕質(zhì)碳酸鈣為載體有利于制劑的快速潤(rùn)濕,但需在其含量較高的情況下同時(shí)提高SDS的含量,才可明顯改善制劑的潤(rùn)濕性。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行混料回歸,得回歸模型為:Y1=95020A+658B+806C-1111159AB-1111543AC+259BC(R2=0.8774)。方程中,A=SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值,B=輕質(zhì)碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值,C=高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值,Y1為制劑的潤(rùn)濕時(shí)間(s)。所得回歸模型為B-9987WP潤(rùn)濕時(shí)間與3種助劑和載體組分的經(jīng)驗(yàn)方程,R2為0.8774,表明該回歸模型能較好地預(yù)測(cè)B-9987WP的潤(rùn)濕時(shí)間。從圖3中可看出,在確定載體輕質(zhì)碳酸鈣含量的情況下,提高SDS的含量對(duì)pH值影響不大,表明SDS對(duì)制劑pH值影響不顯著;而隨著輕質(zhì)碳酸鈣含量的增加,pH值明顯升高,表明載體中高嶺土和輕質(zhì)碳酸鈣的比例對(duì)制劑pH值影響較大。其混料回歸模型為:Y2=209.5A+10.1B+8.0C-237.3AB-237.2AC+2.2BC(R2=0.9954)。方程中Y2代表可濕性粉劑的pH值。所得回歸模型為B-9987WPpH值與3種助劑和載體組分的經(jīng)驗(yàn)方程,R2為0.9954,表明該回歸模型能很好地預(yù)測(cè)B-9987WP的pH值。2.3.1.最佳配方的確定及驗(yàn)證從圖4中可看出:載體輕質(zhì)碳酸鈣含量對(duì)B-9987WP懸浮率影響最為明顯,當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在55%以上時(shí),制劑懸浮率可達(dá)到70%以上(區(qū)域3);但提高高嶺土的比例則會(huì)降低制劑的懸浮率(區(qū)域2和區(qū)域1);當(dāng)輕質(zhì)碳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)80%,同時(shí)提高助劑SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)至9%以上,則制劑的懸浮率可達(dá)75%以上(區(qū)域4)。表明輕質(zhì)碳酸鈣有利于制劑懸浮率的提高,并且只有在輕質(zhì)碳酸鈣含量較高的情況下,再增大助劑含量才能進(jìn)一步提高制劑的懸浮率。其混料回歸模型為:Y3=70389A+484B+475C-82063AB-82201AC+249BC(R2=0.9981)。方程中Y3代表制劑的懸浮率(%)。該回歸模型為B-9987WP懸浮率與3種助劑和載體組分的經(jīng)驗(yàn)方程,R2為0.9981,表明該回歸模型能很好地預(yù)測(cè)B-9987WP的懸浮率。利用Minitab軟件中的響應(yīng)優(yōu)化設(shè)計(jì),選擇期望潤(rùn)濕時(shí)間為90.00s,pH值為8.50,懸浮率為75.00%,經(jīng)軟件分析得到3個(gè)響應(yīng)因子的最佳配比分別為:助劑SDS9.54%,載體輕質(zhì)碳酸鈣83.74%、高嶺土6.72%,預(yù)測(cè)懸浮率為75.15%,pH值為8.62,潤(rùn)濕時(shí)間為89.40s。該配方中3個(gè)指標(biāo)的復(fù)合隨意性達(dá)95.73%,表明目的期望可靠,達(dá)到預(yù)測(cè)指標(biāo)的可能性極大。對(duì)優(yōu)化后配方的驗(yàn)證結(jié)果見表3。從中可知,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值較接近,表明優(yōu)化后的配方比較可靠,其潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率均符合農(nóng)藥可濕性粉劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求,pH值也有小幅降低。因此,該配方可作為B-9987WP的固體介質(zhì)使用。3助劑篩選、混料設(shè)計(jì)及配方優(yōu)化通過(guò)助劑篩選及混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法,對(duì)海洋芽孢桿菌B-9987可濕性粉劑的配方進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后制劑的懸浮率(73.13%)和潤(rùn)濕性(潤(rùn)濕時(shí)間,100.00s)比原本單純添加輕質(zhì)碳酸鈣的制劑(表1中CK,懸浮率31.87%,潤(rùn)濕時(shí)間167.00s)有了大幅度提高,pH值低于8.70。優(yōu)化后制劑的潤(rùn)濕性和懸浮率無(wú)需經(jīng)過(guò)高耗能的氣流粉碎過(guò)程即可達(dá)到農(nóng)藥可濕性粉劑標(biāo)準(zhǔn)的要求,因而可明顯降低生產(chǎn)成本,為該制劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。目前尚未見有關(guān)微生物農(nóng)藥可濕性粉劑中助劑與生防細(xì)菌生物相容性篩選的研究報(bào)道,僅有部分涉及真菌與助劑生物相容性［20，23–25］的研究,發(fā)現(xiàn)不同生防真菌與不同助劑之間生物相容性差異很大。筆者采用平板培養(yǎng)法,系統(tǒng)研究了助劑與海洋芽孢桿菌的生物相容性,結(jié)果表明,生防細(xì)菌與不同助劑之間生物相容性差異也很大?；炝显O(shè)計(jì)是一種統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法,目前尚未見采用統(tǒng)計(jì)優(yōu)化的方法研究可濕性粉劑配方的報(bào)道,只有少數(shù)報(bào)道將該方法應(yīng)用于可濕性粉劑助劑篩選以及復(fù)配助劑的研究［23，27］。本研究通過(guò)混料設(shè)計(jì)試驗(yàn),對(duì)B-9987可濕性粉劑的配方進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,利用統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法可以對(duì)可濕性粉劑的配方進(jìn)行系統(tǒng)研究,改變了傳統(tǒng)的、比較粗放的可濕性粉劑配方優(yōu)化方法。根據(jù)優(yōu)化后的配方進(jìn)行小試生產(chǎn),所制備的可濕性粉劑的懸浮率和潤(rùn)濕性均可達(dá)到相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求,其pH值符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。但目前尚未對(duì)該優(yōu)化后的配方進(jìn)行規(guī)?；糯蟆Ｓ捎谛≡囋O(shè)備和中試設(shè)備的作用方式不同,通過(guò)2種方式制備的可濕性粉劑的性能可能存在較大差異。因此本研究中優(yōu)化后的配方還需經(jīng)過(guò)規(guī)?；糯笤囼?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,再根據(jù)放大試驗(yàn)過(guò)程中存在的問(wèn)題進(jìn)一步優(yōu)化。此外,后續(xù)還可考慮就多種助劑復(fù)配使用的情況進(jìn)一步展開研究。1.3.1可濕性指數(shù)的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)