egcg對(duì)c57bl6小鼠模型的影響

egcg對(duì)c57bl6小鼠模型的影響

非脂肪食品。為了探討EGCG與毛發(fā)生長(zhǎng)的關(guān)系,筆者以C57BL6小鼠作為動(dòng)物模型,觀察EGCG對(duì)小鼠脫發(fā)模型毛發(fā)生長(zhǎng)及毛發(fā)周期的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小鼠皮色糯米粉C57BL6小鼠,雌性,8周,15~20g,同系,共24只,中國(guó)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物中心提供。選擇皮色粉紅,毛發(fā)屬于休止期的小鼠。C57BL6小鼠的毛發(fā)周期同步,可根據(jù)其皮膚顏色判斷毛發(fā)周期的階段變化,毛發(fā)生長(zhǎng)期皮膚呈黑色,退行期呈灰色,休止期呈粉紅色。1.1.2主試劑1.2方法1.2.1小鼠背毛消毛將松香與石蠟1:1混合加熱融化后,均勻涂于小鼠背部,涂抹面積約2cm×3cm,冷卻凝固后揭去,以去除背毛。確認(rèn)毛發(fā)生長(zhǎng)期處于休止期。1.2.2動(dòng)物分組及給藥脫毛次日,選取脫毛區(qū)光滑無(wú)皮膚破損的小鼠,隨機(jī)分為4組,每組動(dòng)物數(shù)6只。分別是:(1)實(shí)驗(yàn)組:給予8%EGCG乙醇制劑;(2)陽(yáng)性對(duì)照組:給予5%米諾地爾溶液;(3)基質(zhì)組:給予基質(zhì)液(乙醇);(4)陰性對(duì)照組:不涂抹藥物。1.2.3給藥1.2.4皮膚組織病理學(xué)檢測(cè)每天觀察小鼠皮膚及毛色變化,記錄每只動(dòng)物背部去毛區(qū)皮膚顏色從涂藥到開(kāi)始變黑的時(shí)間;陰性對(duì)照組記錄脫毛后第1天到開(kāi)始去毛區(qū)皮膚變黑的時(shí)間;去毛區(qū)開(kāi)始變黑到長(zhǎng)滿毛的時(shí)間,并定期拍照。第4、12、20天時(shí),取各組小鼠背部相同位置皮膚組織塊,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片,切片厚約4~5μm,HE染色,光鏡下觀察。觀察指標(biāo)如下:(1)一般組織學(xué)檢查:觀察皮膚完整性,有無(wú)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等反應(yīng)及程度;(2)毛囊計(jì)數(shù),每例數(shù)3個(gè)高倍視野(×400)的毛囊數(shù),取其均值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。1.2.5統(tǒng)計(jì)評(píng)估2結(jié)果2.1皮膚黑色及灰色持續(xù)的時(shí)間(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠在拔毛后第5~6天局部皮膚逐漸出現(xiàn)黑色,毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期,10天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出,20天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期),皮膚黑色及灰色共持續(xù)約15天;(2)陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在拔毛后第5天局部皮膚漸出現(xiàn)黑色,毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期,9天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出,20天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期),皮膚黑色及灰色共持續(xù)15天;(3)基質(zhì)組、陰性對(duì)照組小鼠均在拔毛后第6天局部皮膚由粉紅色變?yōu)楹谏?10天后新的毛發(fā)長(zhǎng)出,19天時(shí)皮膚顏色又經(jīng)灰色變?yōu)榉奂t色,皮膚黑色及灰色共持續(xù)13天。2.3小鼠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異實(shí)驗(yàn)第20天,各組小鼠毛囊數(shù)目見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有極顯著性差異,P<0.001,基質(zhì)組與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,P>0.05。且實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異,P>0.05。3皮膚長(zhǎng)期毒性作用EGCG是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。研究發(fā)現(xiàn),EGCG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)不同程度的抑制作用,其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯,對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響等有關(guān)。也有報(bào)道顯示EGCG對(duì)正常的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞有促增殖作用。2006年Kwon等首次報(bào)道了EGCG可促進(jìn)人毛發(fā)生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)李梅云、范衛(wèi)新等研究也發(fā)現(xiàn)一定濃度的EGCG可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人毛囊生長(zhǎng)和毛乳頭細(xì)胞增殖。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)EGCG對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期影響的相關(guān)報(bào)道。本研究以C57BL6小鼠為模型,設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照,觀察外用EGCG溶液對(duì)毛發(fā)周期、毛囊密度、毛囊形態(tài)的影響。C57BL6小鼠是研究毛發(fā)周期的動(dòng)物模型,毛發(fā)呈周期性生長(zhǎng),毛發(fā)周期分生長(zhǎng)期、退行期和休止期。。該小鼠毛發(fā)呈黑色,皮膚中的黑素細(xì)胞均分布于毛囊,僅在毛發(fā)生長(zhǎng)期才合成分泌黑素,并將黑素傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞,使皮膚呈黑色;在毛發(fā)退行期,黑素合成減少,皮膚逐漸由黑色變?yōu)榛疑?休止期無(wú)黑素合成,皮膚呈粉紅色。經(jīng)組織學(xué)驗(yàn)證,該小鼠皮膚顏色的變化能反映毛發(fā)生長(zhǎng)周期的不同時(shí)段。該小鼠在6~8周飼養(yǎng)良好狀態(tài)下,所有毛囊均由生長(zhǎng)期(皮膚黑色)進(jìn)入休止期(皮膚粉色)狀態(tài),而且在生理狀態(tài)下不再自發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期,但經(jīng)人為拔毛后可被誘導(dǎo)進(jìn)入生長(zhǎng)期,拔毛后第5~6天皮膚顏色變黑(生長(zhǎng)期第Ⅳ亞期),黑色持續(xù)12天又轉(zhuǎn)為灰色(退行期),2天后皮膚轉(zhuǎn)為粉紅色(休止期)。米諾地爾溶液是臨床應(yīng)用極為廣泛的一種治療各類脫發(fā)的藥物,有研究表明,其可以使毛發(fā)提前進(jìn)入生長(zhǎng)期,延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間,并縮短休止期,并能使毛囊增大。故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽(yáng)性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚顏色提前24h由粉紅色變?yōu)楹谏?推遲24h由黑色變?yōu)榛疑?毛囊生長(zhǎng)期時(shí)間較陰性對(duì)照組長(zhǎng)近72h,表現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果相似。提示EGCG與米諾地爾一致,可誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期,延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間,并推遲進(jìn)入退行期。我們還發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)第4天時(shí),切取每組小鼠背部皮膚,觀察到實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組皮下血管網(wǎng)豐富,血管較粗;而基質(zhì)組和陰性對(duì)照組未見(jiàn)此現(xiàn)象。推測(cè)EGCG和米諾地爾一樣具有促進(jìn)血管增生的作用。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)第20天,我們觀察到實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠毛囊數(shù)目,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有極顯著性差異,P<0.001;基質(zhì)組與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,P>0.05;實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異,P>0.05。由此可見(jiàn)EGCG具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用,且此作用與米諾地爾相當(dāng)。本研究結(jié)果顯示EGCG可誘導(dǎo)C57BL6毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期,延長(zhǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間,并推遲進(jìn)入退行期,具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用,可能與其促進(jìn)血管增生作用有關(guān)。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)EGCG可促進(jìn)人毛發(fā)及體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)和體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖。但人與動(dòng)物有著種屬差異,故EGCG促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。EGCG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)E4143;5%米諾地爾溶液(商品名:蔓迪)。局部皮膚直接用棉簽涂抹給藥,每天定時(shí)給藥1次,每次給藥量為0.1ml,連續(xù)給藥20天。采用SPSS.11統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。2.2皮膚he染色觀察2.2.1實(shí)驗(yàn)第4天時(shí),切取每組小鼠背部皮膚,可觀察到實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組皮下血管網(wǎng)豐富,血管較粗;而基質(zhì)組和陰性對(duì)照組未見(jiàn)此現(xiàn)象,見(jiàn)圖1。