西藏紅雪茶多糖含量測定方法的研究

西藏紅雪茶多糖含量測定方法的研究

紅雪茶系地衣科和地衣科的一種植物。形如珊瑚,水泡色紅,味苦腥帶甘。主要分布在四川省九寨溝、玉龍雪山、牦牛山、藥山等、云南省德欽、麗江玉龍雪山、陜西省太白山、青藏高原等海拔數千米的高原之間,生長在落葉松、冷杉干枯樹干上。少數民族將其作為山野菜及茶飲,國內外研究發(fā)現紅雪茶具有清熱、抗炎、抗疲勞、抗輻射等作用。本課題組在研究中發(fā)現紅雪茶多糖具有降血脂作用,為了探索該藥效作用與紅雪茶多糖含量的關系,擬采用酶標儀,通過測定紅雪茶總糖和紅雪茶還原糖的含量,計算兩者差值的方法,確定紅雪茶中多糖的含量。以此為深入開發(fā)紅雪茶這一珍貴藥用資源提供依據。1儀器、試劑和儀器酶標儀(SynergyH1,美國伯騰儀器有限公司),電子天平(AL204,梅特勒-托利多儀器有限公司),臺式離心機(TDL-40B,上海安亭科學儀器廠),電子控溫電熱套(98-1-B,天津泰斯特儀器有限公司),粉碎機(LK-800A,黃岡永安醫(yī)療器械有限公司),循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B95,鄭州長城科工貿有限公司),真空干燥箱(DZG-6050D,上海森信實驗儀器有限公司),酶標板(costar3590,美國康寧公司);鼠李糖對照品(批號A0134-6166-35-7,華泰生物制品有限公司);紅雪茶購自于西藏,經解放軍302醫(yī)院中藥研究所肖小河研究員鑒定為梅衣科金絲屬中金絲刷(Lethariellacladoniodes)的全株;其余試劑均為分析純;試驗用水為重蒸餾水。2方法和結果2.1紅雪了制備紅雪平均水提物lc稱取紅雪茶干燥粗粉100g,加入20倍水浸泡2h,加熱煮沸45min,二次煎煮加水5倍量,回流30min,合并水煎液,過濾,濾液60℃減壓濃縮干燥,即得紅雪茶水提物(LC)。水提物加水200mL,溶解后加入乙醇使含醇量達到80%,4℃冷藏24h。離心取沉淀物,烘干即得紅雪茶醇沉物(LCA),LCA加水溶解,依次用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(用量皆為1.0U·mg-1)酶解,透析后再用Sevage法除蛋白,烘干即得紅雪茶粗多糖(LCP)。2.2紅雪茶醇沉物供試品溶液精密稱定LC0.1g,置10mL量瓶中,加水定容,即得紅雪茶水提物供試品溶液一(LC1);取LC11mL,置50mL量瓶中,加水定容,得紅雪茶水提物供試品溶液二(LC2)。精密稱定LCA0.1g,置10mL量瓶中,加水定容,搖勻即得紅雪茶醇沉物供試品溶液一(LCA1);取LCA11mL,置50mL量瓶中,加水定容,得紅雪茶醇沉物供試品溶液二(LCA2)。精密稱定LCP0.2g,置10mL量瓶中,加水定容,搖勻即得紅雪茶粗多糖供試品溶液一(LCP1);取LCP11mL,置100mL量瓶中,加水定容,得紅雪茶粗多糖供試品溶液二(LCP2)。2.3對照品溶液的制備稱取105℃烘干至恒重的鼠李糖對照品0.0320mg,置50mL量瓶中,加水溶解并定容,即得質量濃度為0.64g·L-1的對照品貯存液,精密量取1.563mL置10mL量瓶中,加水定容,搖勻,即得0.1g·L-1對照品溶液。2.5苯酚和亞硫酸鈉的制備稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g,溶于131mL濃度為2.0mol·L-1的氫氧化鈉溶液中,將此溶液加入到250mL含有92.5g酒石酸鉀鈉的熱水溶液(水溫小于45℃)中,再加入2.5g重蒸苯酚和2.5g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后定容至500mL,貯存于棕色瓶中,一周后使用。2.6測量波長的選擇2.6.1最大吸收波長確定精密吸取0.1g·L-1對照品溶液1.0mL,蒸餾水,LC2,LCA2,LCP2各0.1mL,分別置10mL具塞試管中,加蒸餾水至2.0mL,精密量取1.0mL6%苯酚的溶液,加入,混勻后,精密量取5.0mL濃硫酸,緩慢加入,搖勻,靜置5min后,置沸水浴中,15min后取出,待冷卻至常溫,分別從各具塞試管中吸取300μL,置酶標板中,以相應試劑為空白,230~999nm掃描吸收光譜,對照品及供試品在480nm處均有最大吸收,故確定最大吸收波長為480nm。2.6.2ds試劑冷卻分別精密吸取蒸餾水、0.64g·L-1對照品溶液、LC1,LCA1,LCP1各0.5mL,置10mL具塞試管中,加1.5mLDNS試劑,混勻后,置沸水浴中,5min后取出,待冷卻至常溫,加水4mL,混勻。分別從各具塞試管中吸取300μL,置酶標板中,230~999nm掃描,吸收曲線呈遞減,無最大吸收峰,且在550nm之前,DNS試劑對測定結果有干擾,結合文獻資料,最終確定測定波長為550nm。2.7標準曲線的繪制2.7.1標準曲線的繪制分別精密吸取0.1g·L-1對照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,置10mL具塞試管中,加蒸餾水至2mL,加1.0mL6%的苯酚溶液,混勻,緩慢加入5.0mL濃硫酸,搖勻,靜置5min,置沸水浴中加熱15min后取出,以相應試劑為空白,于480nm處測定OD值,以鼠李糖的含量為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。標準曲線方程為OD=0.0514C-0.0146(r=0.9992),在2.5~12.5mg·L-1有良好的線性關系。2.7.2標準曲線的繪制分別精密吸取0.64g·L-1對照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,置10mL具塞試管中,加水至0.5mL,加1.5mLDNS試劑,混勻,置沸水浴中加熱5min后取出,以相應試劑為空白,于550nm處測定OD值,以鼠李糖的含量為橫坐標,光密度為縱坐標,繪制標準曲線。標準曲線方程為OD=0.0229C-0.086(r=0.9999),在8~40mg·L-1有良好的線性關系。2.8精密度測試2.9重復試驗2.10總糖含量測定精密吸取LCP1供試溶液0.4mL,置10mL具塞試管中,按2.7.1項下方法每隔0.5h測定1次吸光度,連續(xù)13次。計算得RSD為1.54%,表明總糖含量測定中,樣品溶液在6h內穩(wěn)定。精密吸取LCP2供試溶液0.5mL,置10mL具塞試管中,按2.7.2項下方法每隔0.5h測定1次吸光度,連續(xù)17次。計算得RSD為1.79%,表明還原糖含量測定中,樣品溶液在8h內穩(wěn)定。2.11樣品取樣性能2.11.加樣回收率試驗精密量取已知總糖含量(61.4%)的LCP29份,分成3組,每組3份,每份4mL,置10mL量瓶中,分別加入鼠李糖對照品溶液(0.1g·L-1)4.5,5.0,5.5mL,加水定容。2.7.1項下條件測定,并計算平均加樣回收率。結果見表1。試驗結果表明,平均回收率在97%~102%之間,上述方法具有良好的回收率。2.11.加樣回收率試驗精密量取已知還原糖含量(1.02%)的LCP19份,分成3組,每組3份,每份6mL,置10mL量瓶中,分別加入鼠李糖對照品(0.64g·L-1)1.8,2.0,2.2mL,加水定容。2.7.2項下條件測定,并計算平均加樣回收率。結果見表3。試驗結果表明,平均回收率在98%~102%,上述方法具有良好的回收率。2.12樣品測定2.12.供試品溶液制備分別取紅雪茶,精密稱定,按2.1及2.2項下方法制備供試品溶液。精密吸取0.4mL供試品溶液,按2.7.1項下條件測定水提物、醇沉物、粗多糖中總糖質量分數,結果分別為69.4%,86.9%,58.6%。2.12.還原糖質量分數測定分別取紅雪茶,精密稱定,按2.1及2.2項下方法制備供試品溶液。精密吸取0.3mL供試品溶液(LCP1取0.5mL),按2.7.2項下條件測定水提物、醇沉物、粗多糖中還原糖質量分數,結果分別為5.85%,4.28%,1.02%。2.13紅雪茶茶多酚的含量由上述紅雪茶總糖含量及還原糖含量,可以分別計算水提物、醇沉物、粗多糖中多糖質量分數為63.6%,82.6%,57.6%。3不同工藝階段紅雪茶多糖含量的變化本實驗中采用苯酚-硫酸法測定總糖含量和3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量,多糖含量為兩者的差值。該法避免了單糖、低聚糖及其他還原性物質對多糖含量測定的干擾,所得多糖含量更接近真實值?？偺呛瓦€原糖測定中,曾分別選用葡萄糖、鼠李糖作對照品。顯色劑和不同對照品反應,顯色強度略有不同,所得標準曲線方程也不同,直接導致計算所得含量值有差異。據文獻報道,紅雪茶多糖主要由鼠李糖和半乳糖構成,因而采用鼠李糖作為實驗對照品。實驗中應用酶標儀,其在快速、多通道、用量少等方面較可見-紫外分光光度計有明顯優(yōu)勢,并且SynergyH1酶標儀中的光路徑校正功能有效彌補了在準確性方面的不足。測定結果表明,各個工藝階段,多糖含量有較大差異。經醇沉,紅雪茶總糖含量提高,這與醇沉能去除脂溶性雜質有關;還原糖含量降低,這可能因多糖不溶于乙醇而保留,單糖、低聚糖等易溶于乙醇而去除。另外粗多糖中總糖和還原糖含量均比醇沉物低,可能因一部分多糖與蛋白結合,在除蛋白時隨蛋白一起被去除而損失,在透析時還原糖等小分子被去除有關。通過測定紅雪茶中多糖的含量,為進一步研究藏紅雪茶多糖含量與降血脂作用的藥理藥效提供了依據。2.46紅雪茶粗粉制備的能力研究稱取苯酚200g,加鋁片0.2g,碳酸氫鈉0.1g,常壓油浴蒸餾,收集182℃餾分,稱取該餾分80g,置于100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻后至棕色瓶中,即為80%苯酚液,4℃冷藏備用。精密量取1.875mL80%苯酚液,置25m