LPS注射對家蠶幼蟲MyD88基因的影響獲獎(jiǎng)科研報(bào)告

LPS注射對家蠶幼蟲MyD88基因的影響獲獎(jiǎng)科研報(bào)告摘

要：為探究LPS（脂多糖）等外源物質(zhì)對家蠶MyD88基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)將無菌水、LPS和大腸桿菌注射到5齡家蠶幼蟲體腔內(nèi)，在0、3、6和24h進(jìn)行解剖取樣，通過凝膠電冰分析不同時(shí)間MyD88基因在各組織中的表達(dá)水平。電泳條帶顯示，在脂肪體組織中，注射LPS和大腸桿菌均可引起MyD88基因上調(diào)表達(dá)，6h效果最佳;在中腸組織中，注射LPS3h時(shí)MyD88基因表達(dá)量最高，注射大腸桿菌在6h時(shí)條帶亮度最亮。結(jié)果表明MyD88基因可能響應(yīng)LPS和大腸桿菌引起的家蠶免疫表達(dá)反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：家蠶;MyD88;注射;LPS;大腸桿菌

MyD88是機(jī)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到關(guān)鍵作用[1]。Lord等發(fā)現(xiàn)髓樣分化基因家族的新成員MyD88，認(rèn)為MyD88能夠調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞分化[2]。在哺乳類動(dòng)物中，MyD88基因主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞中[3]。

在家蠶中，MyD88基因在中腸（midgut，MG）、脂肪體（fatbody，F(xiàn)B）、表皮（epidermis，EP）等主要免疫器官中的表達(dá)量相對其他較高[4]。MyD88是家蠶先天免疫通路Toll通路上重要的接頭分子，研究表明，MyD88與活化的Toll受體的TLR結(jié)構(gòu)域連接，再與Tube、Pelle蛋白結(jié)合成三聚體形式，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)[5]。

革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分為LPS（lipopolysaccharide），機(jī)體感染后會(huì)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，LPS作為大腸桿菌（Escherichiacoli）細(xì)胞壁的主要成分，參與大腸桿菌引起的免疫反應(yīng)[6]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠激起昆蟲先天免疫反應(yīng)，同時(shí)BmToll9-2基因在家蠶幼蟲的不同組織參與LPS等外源病原體的識(shí)別過程[7]。然而，作為Toll通路的下游因子MyD88能否對LPS做出免疫反應(yīng)，目前在家蠶中還未明確。

本文利用注射法，對家蠶5齡幼蟲進(jìn)行不同處理，通過凝膠電泳條帶，分析MyD88基因在不同處理下的表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步揭示家蠶Toll通路中MyD88基因?qū)用嫔厦庖呦到y(tǒng)對特定外源物質(zhì)的響應(yīng)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

本研究使用廣東省農(nóng)科院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供的P50品系家蠶。孵化后的幼蟲在25℃、60%的相對濕度、光周期12L：12D條件下，以新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2家蠶幼蟲的注射實(shí)驗(yàn)及解剖取樣

對家蠶幼蟲分別注射10μLLPS溶液（2.5mg/μL）和10μL大腸桿菌稀釋液（2.5×106cells/μL），同時(shí)以注射等量無菌水作為陰性對照。在注射后的0、3、6和24h進(jìn)行解剖取樣，平行取樣3組，所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，保存于-80℃冰箱備用。

1.3RNA的提取和cDNA的合成

采用RNAisoPlus（TaKaRa）試劑盒，按其說明書提取總RNA，并用NanoDrop2000檢測，置于-80℃保存。參照PrimeScriptⅡ1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa）說明書，采用10μL的反應(yīng)體系;25℃10min，42℃60min的反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4PCR擴(kuò)增和凝膠電泳

使用PrimerPremier6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內(nèi)參基因選擇BmActin基因，檢測基因?yàn)镸yD88基因。采用2×TaqPCRMasterMix（艾德萊）試劑盒和20μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃2min;94℃30s，52℃30s，72℃30s，共33次循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理后脂肪體組織中BmMyD88基因表達(dá)水平分析

通過凝膠電泳圖分析，注射無菌水時(shí)，MyD88基因在0、3h條帶較暗，6、24h的條帶亮度相近（圖1：A）;注射LPS時(shí)，MyD88基因在3h的條帶亮度明顯增強(qiáng)，6h達(dá)到最亮，24h減弱到最暗（圖1：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在3h的條帶亮度略微增強(qiáng)，6h條帶最亮（圖1：C）。

2.2不同處理后中腸組織中BmMyD88基因表達(dá)水平分析

通過凝膠電泳圖分析，注射無菌水時(shí)，MyD88基因在0、3、6和24h的條帶亮度相對一致（圖2：A）;注射LPS時(shí)，MyD88基因在3h的條帶亮度明顯增強(qiáng)，6、24h逐漸變暗（圖2：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在6h的條帶最亮，24h的條帶亮度減弱到與3h相近（圖2：C）。

3討論

本實(shí)驗(yàn)對家蠶5齡幼蟲進(jìn)行LPS注射，結(jié)果顯示，注射LPS后MyD88基因均能在脂肪體和中腸中于不同時(shí)間段被誘導(dǎo)表達(dá)，中腸中效果更加明顯。中腸作為細(xì)菌經(jīng)口侵入家蠶體內(nèi)的第一道防線，感染后能抗菌基因的表達(dá)，引起腸道免疫反應(yīng)[8]，同時(shí)家蠶幼蟲在5齡階段接近變態(tài)發(fā)育，此時(shí)中腸的蛋白種類與數(shù)量提高，中腸活動(dòng)十分旺盛[9]。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用大腸桿菌注射檢驗(yàn)，對比發(fā)現(xiàn)，分析發(fā)現(xiàn)大腸桿菌較LPS誘導(dǎo)效果更佳、時(shí)長更久。推測由于大腸桿菌含有更多的LPS，另一方面同時(shí)大腸桿菌中含有與家蠶Toll通路中相互作用的活性物質(zhì)，從而促進(jìn)對家蠶MyD88基因的誘導(dǎo)表達(dá)[10]。

哺乳動(dòng)物中TLR4被LPS激活后會(huì)引起早期的MyD88依賴型信號(hào)通路[11]，昆蟲的Toll9具有和哺乳動(dòng)物TLR4在進(jìn)化上相對保守，結(jié)構(gòu)相似[12-13]。張若男等研究發(fā)現(xiàn)，BmToll9蛋白在家蠶響應(yīng)LPS的免疫途徑與哺乳動(dòng)物中響應(yīng)LPS的蛋白受體TLR4極其類似[14]，推測家蠶Toll通路中MyD88基因也能被LPS激活，參與LPS和大腸桿菌引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，注射LPS和