hplc法測(cè)定茶葉中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因

hplc法測(cè)定茶葉中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因

茶葉是中華民族的傳統(tǒng)保健飲料，歷史悠久，在人們的生活中發(fā)揮著重要作用。作為一種天然產(chǎn)物,茶葉產(chǎn)地眾多,而且加工又各有差異,使得茶葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)始終難以統(tǒng)一,目前主要以色、香、味等主觀的感覺(jué)為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判。茶多酚是茶葉的重要組成部分,是一種高效低毒的自由基清除劑,主要含兒茶素類成分,其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是茶多酚的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等廣泛而確切的作用。咖啡堿(Cafeine,CAF)是茶葉中含量最高的含氮化合物,具有興奮精神、解除疲勞、止渴生津、散熱鎮(zhèn)痛等作用,是重要的醫(yī)用原料和食品添加劑,但由于CAF具有較強(qiáng)的中樞興奮作用,其含量往往受到控制。因此,以EGCG和CAF為指標(biāo)對(duì)茶葉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)有一定的意義。目前,茶葉中EGCG和CAF的含量測(cè)定主要采用的是HPLC法,但均有不盡人意之處,如采用梯度洗脫,分析時(shí)間較長(zhǎng);兒茶素類成分易氧化,測(cè)定方法不穩(wěn)定等。本文采用等度洗脫,茶葉中的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因在20min內(nèi)得到理想分離,并對(duì)其中的EGCG和CAF進(jìn)行了含量測(cè)定,以期為茶葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品、化學(xué)品和儀器Agilent1200高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器),1810D自動(dòng)雙重純水蒸餾器,SartoriusCP225D電子天平,DSY-1-2恒溫水浴鍋;EGCG對(duì)照品,(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,批號(hào)為050119,純度>98%);CAF對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制藥品檢定所,批號(hào)100101-198403);茶葉樣品(由福建省永春縣林業(yè)局提供);焦亞硫酸鈉;乙二胺四乙酸(EDTA);甲醇(HPLC試劑,SKChemicalsUlsan680-160,Koroa);水(自制重蒸餾水);甲酸(分析純)。1.2流動(dòng)相、柱溫色譜柱:HypersilODSC18(4.0mm×250mm×5μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸(30∶70);流速為0.5ml/min;柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm。1.3溶液的制備1.3.1混合對(duì)照品溶液精密稱取干燥后的EGCG、CAF對(duì)照品及焦亞硫酸鈉、EDTA適量,用含0.1%甲酸的水溶解后定容,得到EGCG濃度為1254μg/ml、CAF濃度為244μg/ml的混合對(duì)照品溶液,并含0.1%焦亞硫酸鈉和0.01%的EDTA。1.3.2浸提液的制備將茶葉樣品適當(dāng)粉碎,干燥后精密稱取約5g于燒杯中,加入10倍量的水,95℃水浴浸提1h,冷卻至室溫,過(guò)濾。濾渣同上法再提取1次,并用少量水洗滌燒杯和樣品殘?jiān)?合并濾液,定容至100ml的量瓶中。精密吸取1ml,用水定容于5ml的棕色量瓶中,即得供試品溶液。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。2方法和結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、0.6、0.8、1.2、2.0ml,用含0.1%甲酸的水定容至2ml量瓶中,搖勻,按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析結(jié)果(圖1)。并分別以各組分的濃度(C)對(duì)峰面積(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到EGCG線性方程A=42.6C-13067(r=0.9995),CAF線性方程A=95.3C+103.8(r=0.9994)。結(jié)果表明,EGCG檢測(cè)濃度的線性范圍為313.5～1254μg/ml,CAF檢測(cè)濃度的線性范圍為61～244μg/ml。2.2溶液進(jìn)樣測(cè)定精密吸取濃度為376.2μg/ml的EGCG、濃度為73.210μg/ml的CAF混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次,每次20μl,用“1.2”項(xiàng)下色譜條件分析,峰面積的RSD分別為1.15%和0.57%。結(jié)果表明,本方法精密度良好。2.3進(jìn)樣量與進(jìn)樣量取新制備的鐵觀音(秋茶)樣品溶液,每隔一定時(shí)間進(jìn)樣分析1次,進(jìn)樣量為20μl。結(jié)果表明,樣品溶液在制備好后的20h內(nèi),EGCG和CAF的峰面積的RSD分別為1.99%和1.29%,說(shuō)明樣品中的測(cè)定組分在20h內(nèi)穩(wěn)定,可以進(jìn)行含量測(cè)定。2.4加樣樣品中ecgg和caf含量的測(cè)定取鐵觀音末(秋茶)樣品,按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備5份樣品溶液,進(jìn)樣20μl。依據(jù)所得峰面積值可獲得EGCG和CAF在茶葉樣品中的含量,EGCG平均含量為6.68%,CAF平均含量為1.76%,其RSD分別為2.12%和0.64%。結(jié)果表明,本法重復(fù)性較好。2.5加樣回收和精密度精密稱取已知含量的鐵觀音末(春茶)約2.5g,按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備5份樣品溶液,加入適量對(duì)照品、焦亞硫酸鈉和EDTA,用水定容,搖勻。各樣品溶液用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,進(jìn)樣量20μl,結(jié)果表明(表1,表2)EGCG平均回收率101.96%,RSD為2.72%;CAF平均回收率為104.97%,RSD為0.87%。2.6色譜條件進(jìn)樣分析各茶葉樣品按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備3份樣品溶液,用“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,進(jìn)樣量為20μl。將獲得的各組分峰面積值代入相應(yīng)的回歸方程中,求取各樣品溶液的濃度,計(jì)算各組分在茶葉樣品中的含量(表3)。3加合物的氧化反應(yīng)在線性考察過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)EGCG存在轉(zhuǎn)化或者被氧化的現(xiàn)象。EGCG是二十二聯(lián)苯酚基苯并吡喃與沒(méi)食子酸形成的酯,具有酚類抗氧化劑的通性,因此很容易被氧化或發(fā)生轉(zhuǎn)化。為了防止EGCG的氧化或發(fā)生轉(zhuǎn)化而影響測(cè)定結(jié)果,在配制對(duì)照品溶液時(shí),加入了適量的抗氧劑焦亞硫酸鈉和金屬絡(luò)合劑EDTA以消除氧化作用和微量金屬離子對(duì)自動(dòng)氧化反應(yīng)的催化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入適量的焦亞硫酸鈉和EDTA,不影響樣品的測(cè)定結(jié)果,同時(shí)增加了測(cè)定方法的穩(wěn)定性。在所收集的茶葉樣品中,檢測(cè)到鐵觀音中EGCG和C