色譜分離測定藥物對映體的研究進展

色譜分離測定藥物對映體的研究進展

手性藥物對藥物有重要影響。據(jù)報道，大多數(shù)天然藥物和半合成藥物都有手稿，其中98%以上是光學活性物質(zhì)。40%是合成藥物，700多種藥物中至少有一個中心，其中90%是外物。手性是生物體系的一個基本特征,很多內(nèi)源性大分子物質(zhì),如酶、載體、受體、血漿蛋白和多糖等都具有手性特征。手性對映體藥物通過與體內(nèi)大分子的不同立體結(jié)合,可產(chǎn)生不同的吸收、分布、代謝和排泄過程,從而導致藥物動力學參數(shù)的變化。由于手性藥物的兩個對映體的體內(nèi)藥動學過程不同,而可能具有不同的藥理作用,甚至藥效拮抗,也可能一個對映體是消旋體藥物不良反應的根源。因此手性藥物的分離測定,對研究手性藥物的體內(nèi)藥動學過程,確定藥動學參數(shù),藥理和毒理作用機制,以及手性藥物質(zhì)量控制等都具有重要意義。利用氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、超臨界色譜和毛細管電泳分離藥物對映體,成為新藥研究和分析化學的領域之一。色譜分離藥物對映體分為間接法和直接法。前者又稱手性試劑衍生化法(CDF),后者可分手性流動相添加劑法(CMPA)和手性固定相法(CSP)。無論哪一種方法,都是以現(xiàn)代色譜分離技術(shù)為基礎,引入不對稱中心(或光活性分子)。不同的是CDF法是將其引入分子內(nèi),而CMPA和CSP則引入分子間。引入手性環(huán)境使藥物對映體間呈現(xiàn)理化特性的差異是色譜拆分的基礎。本文綜述了近年來利用色譜分離測定藥物對映體研究的新進展。1間接法間接法是藥物對映體在分離前,先與高光學純度衍生化試劑(CDA)反應形成非對映體,再進行色譜分離測定。1.1試劑、手性藥物和反應產(chǎn)物的消旋化反應手性試劑及反應產(chǎn)物在化學上和手性上都很穩(wěn)定,其光學性在貯存中不發(fā)生改變;在衍生化反應和色譜條件下,試劑、手性藥物和反應產(chǎn)物不發(fā)生消旋化反應;衍生化反應生成的非對映體在色譜分離時應能顯示高柱效;手性試劑應具有UV或熒光等敏感結(jié)構(gòu),能使生成物具有良好的可檢測性;手性化合物對映體的化學結(jié)構(gòu)中應具有易于衍生化基團,如氨基、羰基、羧基和巰基等。1.2手性試劑的選擇非對映體在色譜系統(tǒng)中的差速遷移與下列因素有關,非對映體分子的手性結(jié)構(gòu)、手性中心所連接的基團和色譜系統(tǒng)的分離效率(包括溶質(zhì)分子與固定相和流動相之間的結(jié)合力,如氫鍵、偶極-偶極、電荷轉(zhuǎn)移和疏水性等)。非對映體衍生物良好的分離度,以及衍生化反應的較高的選擇性,都取決于手性試劑的選擇、反應產(chǎn)物手性基團的結(jié)構(gòu)和生成的化學鍵類型。反應產(chǎn)物的構(gòu)型差異越大,分離越容易。1.3hplc-ms聯(lián)用技術(shù)檢測衍生物的應用對映體的可檢測性隨著手性反應所生成的衍生物不同而發(fā)生改變,常用UV、熒光和電化學檢測,隨著HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,已有用MS檢測的報道。1.4手性試劑的類型和應用1.4.1在非對映射體分離該類手性試劑容易與多數(shù)醇類及胺類手性化合物反應,生成非對映體而被分離。被廣泛應用于氨基酸及其衍生物、兒茶酚胺類、苯丙胺類、麻黃素類、醇類、腎上腺素類、腎上腺素拮抗劑及環(huán)氧化合物等的分離,其反應迅速,具有立體選擇性,反應條件溫和,生成的硫脲非對映體可以直接用反相和正相色譜分離。1.4.2對氨基酸的分離其化學性質(zhì)分屬于酸、醛、胺、酯或酰氯等,但都有特征結(jié)構(gòu)-萘基。α-萘乙酸的甲氧基衍生物用于20多種氨基酸的分離,萘氮甲酸酯可用于伯胺、仲胺和叔胺的分離;萘甲酰氯、萘丙酰氯用于苯丙胺的原料、緩釋劑、糖劑等多種劑型的手性對映體的分析測定。1.4.3映射體衍生化的方式該類手性衍生化試劑多用于胺、氨基酸及醇類藥物的拆分,其非對映體衍生化通常有兩種情況:一是直接與樣品縮合,生成酰胺或酯后,以反相或正相色譜分離;二是將樣品先與酰氯或磺酰氯反應,然后引入其它基團(多為芳基),合成更有利于拆分與檢測的非對映體。1.4.4氨基酸衍生物試劑光學純度氨基酸及其衍生物是最早采用的色譜手性試劑,先在GC法中應用,80年代迅速應用于HPLC法。廣泛用于胺、羧酸及醇類藥物的拆分,尤以氨基酸為最佳。其衍生化法多基于肽合成原理,此類試劑以L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸及其衍生物為多,為了改善檢測靈敏度常引入芳基;為了提高反應活性和定量的回收率,常將羧基轉(zhuǎn)化成?；⑺狒?。1.4.5利用代酒石酸酐類羧酸可用冠醚催化與L-2-溴辛烷酯化的方法,O,O-二取代酒石酸酐類用于15種重要心血管類藥物的拆分。鄰苯二醛在手性硫醇存在下,可將胺類衍生化成異吲哚類,這類化合物通常具有強烈熒光和良好的分離度,廣泛用于拆分氨基酸、胺和硫醇。1.5衍生化試劑的選擇分離時可用價廉、柱效高的非手性柱;反應時可選擇衍生化試劑提高檢測靈敏度。缺點是衍生化反應使分離時間延長,操作較復雜;對衍生化試劑的要求較高;要求對映體的衍生化反應迅速且反應速率一致。2直接法直接法是引入“手性識別”或“手性環(huán)境”(手性固定相、手性流動相添加劑)至色譜系統(tǒng)中,以形成暫時非對映體復合物,從而使藥物對映體分離。2.1手性流動相原料cmpaCMPA按其分離原理和添加劑類型分為八種。2.1.1對映射體的理化性質(zhì)和功能經(jīng)常采用的添加劑是手性環(huán)糊精和手性冠醚。環(huán)糊精分子為錐形筒體,筒腔內(nèi)部呈相對疏水,可與客體的極性部分形成氫鍵締合。而冠醚則與之相反,腔內(nèi)親水性較高,腔外為疏水性。因此,對疏水性和親水性藥物對映體都具有很強的包合作用,并使包合物理化性質(zhì)發(fā)生改變。對映體分子進入手性空腔后即發(fā)生主-客反應而被拆分。該法已用于氨基酸及其衍生物(巴比妥類、氯胺酮、苯妥英代謝物、叔丁喘寧、美芬妥因及其代謝物、哌嗪類鎮(zhèn)痛藥、甲基炔諾酮、偽麻黃堿、17-酮甾體和去甲基安定等)。采用的固定相常為ODS、CN、C3、苯基鍵合相硅膠或硅膠等。檢測手段多用HPLC-UV和GC-ECD。2.1.2手性配合試劑分離手性金屬配合劑加入色譜流動相中,形成三元非對映體配位化合物,由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和能量的差異,并與固定相發(fā)生立體選擇性吸附和排斥反應,使兩對映體得以分離。手性配合試劑多為氨基酸及衍生物(如L-脯氨酸、L-苯丙氨酸等),配位金屬有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+等。該法用于分離氧氟沙星、氨基酸及衍生物、苯妥英類代謝物、多巴胺、氨基醇等;此外酒石酸及其衍生物也用于分離氨基酸、去甲腎上腺素、蘋果酸等,采用反相柱,UV檢測。2.1.3兩種非對應體的分離穩(wěn)定性在低極性的有機流動相中,對映體分子與手性離子對試劑之間產(chǎn)生靜電、氫鍵或疏水性反應生成非對映體離子對。兩種非對應體離子對具有不同穩(wěn)定性,并且在有機相與吸附固定相間的分配行為也有差異,因此得以分離。常用的手性反離子有奎寧、奎尼丁、10-樟腦磺酸、N-苯甲酰氧基羰基-甘氨酸-L-脯氨酸。被分離的藥物有β-阻滯劑、奎寧、奎尼丁、羧酸、磺酸、甲氟嗪、苯丙酰苯心安等。使用的固定相有硅膠、CN、Diol等。2.1.4色譜條件分離甲基化環(huán)糊精和2R,3R-雙正丁基酒石酸等,少量能強烈吸附于固定相表面上,使固定相表面手性化,形成的動態(tài)手性固定相在洗脫過程中與溶質(zhì)相互作用,對映體按與覆蓋于固定相表面的添加劑之間的作用力強弱而被分離。還有將表面活性劑,如膽酸鹽加入到流動相中,色譜過程中形成由非膠束膽酸鹽溶劑化ODS和膽酸鹽膠束吸附于ODS組成的非均態(tài)手性固定相。主要通過分配機制分離對映體。該系統(tǒng)用于拆分巴比妥、導眠酮、β-阻滯劑、麻黃堿、去甲麻黃堿、S-阿托品、后馬托品、扁桃酸等。2.1.5糖鍵功能團的分離藥物對映體基于分子間的弱作用力氫鍵而被分離,并需使用低極性的流動相,在手性添加劑分子中若含有兩個以上的可以形成氫鍵的功能團,則可用于分離與之結(jié)構(gòu)互補的藥物對映體,如含有兩個氫鍵功能團的氨基酸及其生物、氨基醇等。2.1.6蛋白質(zhì)-溶劑混合物分離藥物對映射體蛋白質(zhì)(BSA、α-糖蛋白)作手性添加劑,可通過疏水性、靜電、氫鍵和電荷轉(zhuǎn)移反應,形成蛋白質(zhì)-溶質(zhì)復合物分離藥物對映體。常用的固定相是經(jīng)修飾的中等粒度的硅膠,已用于分離氨基酸、羧酸、疏水性胺類等。2.1.7-氨基戊烷非手性誘導劑利用誘導吸附原理,將手性誘導劑加入到流動相中,與對映體分子共同競爭地吸附到非手性固定相表面,發(fā)生立體反應形成不穩(wěn)定的非對映體復合物,手性誘導劑作為置換劑將對映體區(qū)分性地擠出柱子,如(-)-α-甲芐胺作為手性誘導劑在硅膠柱上拆分2-氨基庚烷。2.1.8特征性操作簡便,分析過程中較少發(fā)生消旋化,添加劑選擇的范圍較寬,純對映體易從柱后洗脫中回收。缺點是系統(tǒng)平衡時間較長,添加劑消耗較大。2.2手性固結(jié)相法csp手性固定相是由擔體鍵合高光學純度的手性異構(gòu)體制作而成。2.2.1pirkle型cps該固定相通過含末端羧基或異氰酸酯基手性前體與氨基鍵合硅膠進行縮合反應,分別形成含酰胺或脲型結(jié)構(gòu)CSP。第一代Pirkle是將2,2,2-三氟(1-9-蒽)乙醇(TFAE)鍵合到硅膠上形成的固定相,其后Pirkle又制備了一系列3,5-二硝基苯甲酰(DNB)氨基酸、醇、胺衍生物CSP,構(gòu)成第二代Pirkle型CPS;第三代Pirkle型CSP有富電子的萘基和較長的鍵合烷基鏈,提高了立體識別能力和通用范圍,此后,又合成了既含π-酸(CDB),又含π-堿(萘基),含有碳、磷、聯(lián)萘等不對稱中心的CSP。近年又相繼合成了氨基磷酸酯及一系列含萘、雜環(huán)的氨基酸衍生物、二氨和由聯(lián)萘、羧酸衍生物的多種CSP,已廣泛用于氨基酸、乙內(nèi)酰脲、內(nèi)酰脲、胺類、醇類及硫醇類藥物對映體拆分。Pirkle柱大多使用正相分離系統(tǒng),流動相常用己烷加少量醇類改性劑。最近Rustum發(fā)現(xiàn)也可以用反相分離系統(tǒng),從而擴展了其應用范圍。2.2.2酸性蛋白手性柱蛋白質(zhì)是一類由手性亞基團(L-氨基酸)組成的高分子聚合物,可識別藥物對映體在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點而達到手性分離。商品化的手性蛋白質(zhì)鍵合相有兩種:一是將牛血清白蛋白(BSA)共價鍵合到硅膠上,用于氨基酸及其衍生物對映體的分離;二是通過離子鍵(或共價鍵)以及蛋白交聯(lián)作用將α-酸性蛋白質(zhì)固定于硅膠上,該類柱穩(wěn)定性好,柱效高。對許多藥物對映體有良好的立體選擇性,可直接分離許多藥物。如硫噴妥因、心得怡及β-阻滯劑等。第三代酸性蛋白手性柱Ovmucoid,是將雞蛋中分離出來的卵粘蛋白鍵合在硅膠上,該類型CSP在很寬的pH范圍內(nèi)有相當?shù)姆€(wěn)定性,能分離許多胺類和羧酸類手性藥物,如氯酚寧胺、苯異丙酸類等。使用蛋白質(zhì)手性固定相時,一般用磷酸或硼酸緩沖液加0%~5%的乙腈、乙醇、丙酮或醚類有機溶劑作流動相。2.2.3環(huán)糊精鍵合固定相的應用環(huán)糊精的手性識別主要來自環(huán)內(nèi)腔對芳烴或脂肪烴類側(cè)鏈的包容作用,以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對映體分子發(fā)生氫鍵作用。β-環(huán)糊精手性鍵合固定相對形成包合物有最佳大小的內(nèi)腔,適用于大多數(shù)藥物對映體的位阻和電子特征,因此,廣為使用;α-環(huán)糊精鍵合固定相適合于分子量小于200的藥物對映體的分析;而γ-環(huán)糊精鍵合固定相適用于較大分子量藥物對映體的分析。90年代以來,又制備出一系列衍生化環(huán)糊精鍵合固定相,如乙?；?β,γ-CD、對甲苯酯-β-CD、氨基甲酸酯-β-CD等。CD衍生化提高了手性識別能力。一般用含甲醇、乙醇、乙腈作為有機改性劑的緩沖溶液作流動相。最近Chang等提出了一種新型流動相(MeCN、MeOH、HOAc、TEA),突破了傳統(tǒng)的正相或反相模式,使20多種過去難以分離的手性藥物對映體達到基線分離。2.2.4對映射體的手性識別纖維素三酯衍生物,如三苯基氨基酯涂敷在大孔硅膠上用作手性固定相,能直接分離許多對映體,該類固定相的手性識別主要來自氨基甲酸酯或酯的部位與被拆分物之間形成氫鍵或偶極-偶極作用,或通過被拆分物分子進入纖維素網(wǎng)狀腔,導致腔內(nèi)立體環(huán)境的改變而實現(xiàn)。纖維素衍生物作CSP常用的流動相為甲醇-水、乙醇、乙醇-水、正己烷-異丙醇。2.2.5聚合物類的用量該固定相使用最多的有兩種:一是在手性條件下不對稱聚合,如用手性催合劑;二是用手性單體。用這兩種技術(shù),可制備有手性識別的聚合物,如聚甲基丙烯的三苯甲酯、聚酰胺等,這類手性聚合物可涂漬或鍵合到硅膠上作CSP,光學活性聚氨酯類主要用于分離含有芳香基團的外消旋體;有螺旋鏈的聚甲基丙烯酸三苯甲酯涂敷在烷基化硅膠表面,在較廣泛的范圍內(nèi)可對消旋體進行分離。這類聚合物CSP柱容量和柱效都較高,但要求被分離藥物須有嚴格的立體構(gòu)型。2.2.6烯基質(zhì)的模擬冠醚源化合物有親水性內(nèi)腔和親脂性外殼,可鍵合在硅膠或聚苯乙烯基質(zhì)上制成手性固定相,根據(jù)主-客化學原理,用于含有能夠質(zhì)子化的伯胺功能團的藥物對映體的分離,尤其是氨基酸及其衍生物的分離。流動相多采用過氯酸水溶液中加入一定比例(≤5%)甲醇。2.2.7鍵合的金屬離子這類CSP分離藥物對映體是基于固定相手性配體、金屬離