分子生物學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

分子生物學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告分子生物學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告外源基因SOC1的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建與篩選班級(jí)姓名學(xué)號(hào)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^PCR技術(shù)克隆外援基因SOC1的目的片段。通過質(zhì)粒提取，酶切和連接技術(shù)，把SOC1基因重組進(jìn)TA克隆載體并完成篩選。實(shí)驗(yàn)用品材料：植物葉片，TA克隆載體試劑：DNA提取液（1L）TE緩沖液；瓊脂糖；核酸染料；；DNAmarker；6×上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青FF、30%甘油）、DNA聚合酶、dNTP、上下游引物器材：研缽，恒溫水浴，離心機(jī)，離心管，PCR儀、生化培養(yǎng)箱、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)，去離子水、超凈工作臺(tái)，低溫臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，水浴鍋，高壓滅菌鍋，酒精燈等。實(shí)驗(yàn)原理通過配制DNA提取液，利用研磨法獲得DNA模板，然后采用PCR技術(shù)擴(kuò)增基SOC1基因獲得目的片段，然后通過酶切和連接方法把SOC1基因連接到TA載體上。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒，則質(zhì)粒DNA與Ca2+形成的復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)過42℃短暫的熱激處理后，DNA與Ca2+形成的復(fù)合物進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，在不含抗生素的培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)入大腸桿菌質(zhì)粒上的抗生素抗性基因表達(dá)，在含相應(yīng)抗生素的選擇培養(yǎng)基上可將轉(zhuǎn)化菌（含質(zhì)粒）與未轉(zhuǎn)化細(xì)菌分開，轉(zhuǎn)化細(xì)菌經(jīng)過不斷分裂增殖形成菌落，而未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌則不能。并通過氨芐抗性篩選獲得重組子實(shí)驗(yàn)方法步驟1、植物基因組DNA的小量提取（1）剪取新鮮幼嫩的植物葉片1~2片于1.5mL離心管中.（2）先加入少量的DNA提取液100μL，用研磨棒充分研磨盡量避免提取液濺出。（3）再加入600μL的DNA提取液，使DNA提取液的總體積為700μL，上下顛倒混合均勻。（4）放入高速離心機(jī)4℃條件下12000rpm離心15min。（5）取上層水相，移入標(biāo)有相應(yīng)序號(hào)的新的離心管中，加入600μL的異丙醇（與加入DNA提取液的總體積相同），上下顛倒混勻。放置于-20℃冰箱中40min或以上，使DNA沉淀。（6）放入高速離心機(jī)，4℃條件下12000rpm離心10min，沉淀DNA，棄上清。（7）加入1mL70%的乙醇洗滌，放入高速離心機(jī)，4℃條件下12000rpm離心5min。（8）重復(fù)步驟（7），洗去DNA中的雜質(zhì)。（9）將離心管倒置在吸水紙上，待干燥后，加入20μL60℃雙蒸水，DNA完全溶解后，放4℃冰箱待用，長(zhǎng)期保存需放入-20℃。2、PCR擴(kuò)增SOC1目的片段（1）準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液10μl體系：ddH2O：4.9μlTaq聚合酶：0.1μl上游引物：1μl下游引物：1μldNTP1μl模板：1μl擴(kuò)增緩沖液1μl總體積：10μl（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)（循環(huán)數(shù)25）PCR程序：1,94℃2min2c，94℃30s3c,55℃30s4c,72℃1min5,72℃10min6,16℃30min3、瓊脂糖凝膠電泳（1）稱取1g瓊脂糖加入250mL錐形瓶中，量取100ml1×TAE電泳緩沖液加入錐形瓶。（2）微波爐加熱并多次搖晃錐形瓶使瓊脂糖充分溶解。（3）待膠冷卻至60℃左右加入7μL的核酸染料，輕搖混勻。（4）向膠板中倒膠，插上梳子，靜置約30min待凝膠完全冷卻。（5）拔出梳子，將凝膠連同支撐用的模具一起轉(zhuǎn)移到加入了1×TAE電泳緩沖夜的電泳槽中，使電泳緩沖液淹沒凝膠，上樣。150V，200mA電泳約20min。（6）取出凝膠，掃膠記錄電泳結(jié)果。4、TA質(zhì)粒DNA的提取和純化（1）取培養(yǎng)過夜的菌液于離心管中，12000rpm離心2min，將上清棄去。重復(fù)操作增加集菌量。（2）加入250μL含RNaseA的SolutionI充分懸浮細(xì)菌沉淀。（3）加入250μLSolutionII緩慢輕輕上下顛倒5~6次，直至溶液透明。（4）加入350μL4℃預(yù)冷過的SolutionIII，緩慢輕輕上下顛倒5~6次，直至凝集塊緊實(shí)，然后室溫靜置2min。（5）常溫條件下，高速離心機(jī)12000rpm離心10min。取上清。（6）將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，并平衡柱子。（7）步驟（5）中的上清轉(zhuǎn)移至SpinColumn，室溫下，高速離心機(jī)調(diào)至12000rpm離心1min。棄濾液。（8）將500μLBuferWA加入SpinColumn，室溫下，高速離心機(jī)調(diào)至12000rpm離心30s。棄濾液。（9）將700μLBuferWB加入SpinColumn，室溫下，高速離心機(jī)調(diào)至12000rpm離心30s。棄濾液。重復(fù)一次。5、質(zhì)粒DNA的限制性酶切小量酶切反應(yīng)體系本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定。典型的反應(yīng)是20μl體積中含0.2—1μgDNA，酶切反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒DNA5μl10×緩沖液1μl限制酶（根據(jù)質(zhì)粒酶切位點(diǎn)選擇）1μl雙蒸去離子水3μl總體積10μl（1）在一滅菌的新的Ep管中加入3μl雙蒸水。（2）加入10×緩沖液1μl。（3）加限制酶1μl。（4）最后加入質(zhì)粒DNA5μl。（5）稍離心，混合。（6）37℃水浴1—1.5h。（7）取出后電泳分析鑒定是否酶解。6、重組載體的連接(1)將的目的片段與對(duì)應(yīng)的空質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，條件一般為37℃，2-3小時(shí)。(2)將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別進(jìn)行回收，測(cè)定濃度，依此來計(jì)算二者之間的分子個(gè)數(shù)的比值。進(jìn)行酶連時(shí)，向300ulEppendorf管中依次加入以下體系：酶切載體3μL目的基因片段1μLSolutionI連接酶4μL（3）16℃水浴鍋中連接，3個(gè)小時(shí)以上。7、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）接種大腸桿菌單菌落于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩（約250r/min）培養(yǎng)過夜。（2）將2mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到盛有100mL的LB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.2~0.4（約2h）。（3）取1mL培養(yǎng)物于一滅菌的1.5ml管中，冰浴放置10min，4℃，1500×g離心5min，棄上清。（4）沉淀用0.2mL冰冷100mmol氯化鈣溶液輕輕懸浮，冰浴放置15min，4℃，1500×g離心5min，棄上清。（5）沉淀再用0.2mL氯化鈣溶液輕輕懸浮，放置在冰浴中，制成大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。8、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（1）取制備好的存放于超低溫冰箱的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，放置于冰上靜止5~10min待其完全溶解。（2）在凈化工作臺(tái)內(nèi)，將質(zhì)粒DNA1ul加入感受態(tài)細(xì)菌100ul的離心管內(nèi)，混勻，置冰上30分鐘。從超凈臺(tái)中取出，置于冰上靜止30min。（3）42℃熱激90s，時(shí)間一定要準(zhǔn)確，迅速轉(zhuǎn)入冰上靜止2min以上。（4）在超凈工作臺(tái)，加入0.9mL不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在搖床中37℃，180rpm培養(yǎng)1h。（5）取出37℃預(yù)熱了30分鐘的LB瓊脂固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100ug/ml）平皿，點(diǎn)上酒精燈，將消毒浸泡的涂布棒涼干。（6）在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)將培養(yǎng)基倒置，過夜培養(yǎng)。主要參考文獻(xiàn)1．《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，美）奧斯伯，２００82．《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，北京大學(xué)出版社，郝福英，1998年3．《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，薩母布魯克著，黃培堂等譯，20054.《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，高等教育出版社，魏群.2007.11實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、DNA提取的電泳圖（根據(jù)跑的電泳結(jié)果畫