從肝論治復(fù)方柴胡疏肝湯和從痰論治定癇丸對戊四氮小鼠海馬區(qū)谷氨酸代謝通路的影響

從肝論治復(fù)方柴胡疏肝湯和從痰論治定癇丸對戊四氮小鼠海馬區(qū)谷氨酸代謝通路的影響

氨基葡萄糖（glu）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)變化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和正常腦功能的維持中起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于神經(jīng)毒性，過度集中的岡布容易引起癲癇發(fā)作。這是癲癇發(fā)作的原因之一。在癲癇發(fā)作過程中，局部glu積聚進(jìn)一步，以增加神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損害，導(dǎo)致癲癇的持續(xù)發(fā)作。癲癇患者癇性發(fā)作前后海馬區(qū)內(nèi)Glu水平明顯升高。近年來Glu及其代謝在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)?！巴‘愔巍笔侵嗅t(yī)辨證論治的特色之一,癲癇屬于中醫(yī)學(xué)“癇病”范疇,其辨證論治亦存在不同的治法,“從痰論治”是癲癇傳統(tǒng)治法,近年來“從肝論治”癲癇臨床上取得客觀療效,本課題組前期研究表明“從痰論治”傳統(tǒng)定癇丸和“從肝論治”復(fù)方柴胡疏肝湯均能抵抗戊四氮(Pentetrazole,PTZ)點(diǎn)燃大鼠癇性發(fā)作,降低PTZ點(diǎn)燃大鼠不同腦區(qū)葡萄糖代謝水平,降低神經(jīng)元興奮性。為了探討兩種治法的抗癲癇作用機(jī)制及二者是否存在差異,本研究聯(lián)合運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)、Westernblot技術(shù)及比色法,觀察并比較了兩復(fù)方對PTZ點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)Glu代謝通路的調(diào)節(jié)作用,探討同病異治理論的分子機(jī)制。材料和方法1材料表面1.1實(shí)驗動物中心提供雄性SPF級Wistar大鼠,體重180～220g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2006-0015,標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),自由攝取水和食物。1.2藥物、試劑與實(shí)驗設(shè)備柴胡疏肝湯組成:柴胡25g黃芩10g半夏10g黨參10g桂枝10g白芍10g大棗4枚甘草10g當(dāng)歸10g生地10g川芎10g鉤藤15g生龍骨30g生牡蠣30g;定癇丸組成:天麻15g川貝母15g半夏10g茯苓10g茯神10g膽南星25g石菖蒲15g全蝎10g僵蠶10g陳皮10g遠(yuǎn)志10g丹參10g麥冬10g甘草10g琥珀粉10g朱砂10g,各藥材均購于廣東省藥材公司,兩復(fù)方均水煎2次,合并兩次濾液并分別減壓濃縮至生藥含量1g/mL和0.5g/mL濃度冷藏備用;PTZ(美國Sigma公司);丙戊酸鈉片(VPA,湖南省湘中制藥有限公司);谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司);兔谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamatetransporter-1,GLT-1)抗體(加拿大Abcam公司);小鼠Actin抗體(碧云天生物技術(shù)研究所);生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)研究所);生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司);谷氨酰胺合成酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);高效液相色譜(HP1050型,美國惠普);高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司);超聲波清洗機(jī)(KQ2200B型,昆山市超聲器有限公司);電熱恒溫水浴箱(DK-S26型,上海精密實(shí)驗設(shè)備有限公司);半干電轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-rad公司);HoferMiniVE型Western電泳印跡系統(tǒng)(美國Amersham公司);柯達(dá)2000MM全光譜多功能活體成像系統(tǒng)(美國Kodak公司);SigmaDiagnostics201型酶標(biāo)儀(美國Sigma公司)。2大鼠海馬區(qū)glt-1和pvdf的表達(dá)變化隨機(jī)選取6只Wistar大鼠為對照組,其余大鼠以亞驚厥劑量PTZ(35mg/kg)每天腹腔注射1次,連續(xù)注射21天,每天注射后觀察大鼠癇性發(fā)作情況,按照RacineR癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn),評價其癇性發(fā)作級別,0級:無發(fā)作反應(yīng);1級:節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動陣攣;2級:點(diǎn)頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動陣攣;3級:出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立;4級:前肢陣攣伴隨直立;5級:全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作而跌倒。選取在(18±3)天內(nèi)至少連續(xù)3次達(dá)4級或4級以上發(fā)作的大鼠,間歇1周后再次以相同劑量PTZ腹腔注射,若其發(fā)作仍達(dá)到4級或4級以上驚厥的大鼠被認(rèn)為是完全點(diǎn)燃成功,對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。選取點(diǎn)燃成功后的大鼠24只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,每組6只,分別為模型組、丙戊酸鈉組、定癇丸組和柴胡疏肝湯組,各組均于點(diǎn)燃成功后第1天起每日上午8:00時、下午6:00時灌胃給藥各1次。對照組和模型組:生理鹽水灌胃2mL/次;丙戊酸鈉組:丙戊酸鈉混懸液200mg/(kg·d)灌胃;定癇丸組:定癇丸水煎液12g/(kg·d)灌胃;柴胡疏肝湯組:柴胡疏肝湯水煎液10g/(kg·d)灌胃。選用兩復(fù)方的臨床常用劑量,根據(jù)《藥理實(shí)驗方法學(xué)》提供的人與大鼠劑量換算關(guān)系,計算大鼠用藥劑量。連續(xù)灌胃給藥28天,于最后一次給藥1.5h后亞驚厥劑量PTZ再次腹腔注射,觀察記錄大鼠癇性發(fā)作情況,10min后10%水合氯醛麻醉下斷頭取腦,冰上分離海馬,-80℃凍存?zhèn)溆?。HPLC熒光法檢測大鼠海馬區(qū)Glu含量精確稱取海馬組織,放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中,并以1∶4(w/v)比例加入80%乙醇冰上勻漿,勻漿液倒入EP管中,5000r/min離心20min,上清液轉(zhuǎn)入燒杯,殘渣再次以上述方法勻漿1次,離心后上清液并入燒杯。燒杯置于80℃恒溫水浴中蒸干,再加入0.1mol/LHCL超聲溶解殘渣,溶解液移入5mL定溶瓶,并沖洗燒杯3次,洗液并入定溶瓶,最后定溶至5mL,抽取一定量HCL混合物于EP管中,4℃、15000r/min離心15min,上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后,上機(jī)進(jìn)樣檢測。精確稱取海馬組織于1.5mLEP管中,液氮研磨2min后以體積比1∶60的比例加入組織蛋白提取液(組織裂解液∶PMSF=100∶1),充分混勻后冰上裂解1h,4℃、12000r/min離心15min,上清液再以4℃、13000r/min離心10min,留取上清液。抽取適量上清液以超純水稀釋至適宜濃度,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線取樣品,樣品經(jīng)5×SDS緩沖液稀釋后于95℃恒溫器中蒸煮5min進(jìn)行蛋白變性,經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,采用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1.5h,然后加入1∶1000稀釋的兔抗GLT-1抗體及1∶1000稀釋的小鼠抗Actin抗體,4℃冰上孵育過夜,再用1∶4000稀釋的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG和1∶4000稀釋的生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫孵育1.5h,最后ECL發(fā)光液孵育后KODAK成像系統(tǒng)曝光成像,反應(yīng)間用TBST充分洗滌。GLT-1條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值,作為衡量目的蛋白的表達(dá)量。谷氨酰胺和羥胺在GS的作用下生成γ-谷氨酰氧戊酸和氨,通過顯色反應(yīng)可以測定谷氨酰氧戊酸的含量。精確稱取海馬組織于預(yù)冷的玻璃勻漿器中,以1∶50(重量/體積)比例加入預(yù)冷的生理鹽水,冰上勻漿,勻漿液移入EP管中,4℃、12000r/min離心15min1次,取上清再以10000r/min離心10min,留取上清。反應(yīng)液制備參照谷氨酰胺合成酶試劑盒說明書進(jìn)行,分空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管,之后分別加入純水、20mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品(γ-谷氨酰羥胺酸)和上述樣品上清液,各50μL,混勻,37℃水浴反應(yīng)15min,加入顯色劑(0.37mmol/LFeCl3,0.67mol/LHCl,0.20mol/L三氯乙酸)終止反應(yīng),3500r/min離心10min,取200μL上清于96孔板中550nm處檢測吸光度。以每小時37℃反應(yīng)生成的γ-谷氨酰氧戊酸1μmoL的量為一個酶的活性單位,按照試劑盒說明書的計算公式計算GS活力。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,實(shí)驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗,若方差齊,采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗,組間比較用LSD法;若方差不齊,采用Welch進(jìn)行檢驗,組間比較采用Games-Howell法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1各組大鼠海馬區(qū)glu含量比較與對照組比較,模型組大鼠海馬區(qū)Glu含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,各用藥組大鼠海馬區(qū)Glu含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與柴胡疏肝湯組比較,定癇丸組及丙戊酸鈉組大鼠海馬區(qū)Glu含量顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。2海馬區(qū)glt-1蛋白表達(dá)水平比較與對照組比較,模型組大鼠海馬區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,各用藥組大鼠海馬區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01);與柴胡疏肝湯組比較,丙戊酸鈉組和定癇丸大鼠海馬區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3各組大鼠海馬區(qū)gs活性的比較與對照組比較,模型組大鼠海馬區(qū)GS活性顯著降低(P<0.01);與模型組比較,各用藥組大鼠海馬區(qū)GS活性均升高(P<0.05,P<0.01);柴胡疏肝湯組與丙戊酸鈉組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而和定癇丸組比較,柴胡疏肝湯組大鼠海馬區(qū)的GS活性升高更顯著(P<0.01)。glu抑制劑的作用腦內(nèi)Glu的水平與癲癇的發(fā)生、發(fā)展及維持密切相關(guān),細(xì)胞外Glu的濃度升高被認(rèn)為是癲癇反復(fù)發(fā)作的重要因素,目前已在多種癲癇動物模型和癲癇患者的腦組織中觀察到了突觸間隙內(nèi)Glu濃度的增加。谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)(Glutamate-Glutamine,Glu-Gln)是Glu的代謝通路,突觸間隙內(nèi)Glu的水平是由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamatetransporters,GluTs)調(diào)控,使其維持在生理水平,發(fā)揮正常突觸傳遞作用,腦內(nèi)GluTs包括EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)、EAAT3、EAAT4和EAAT55種亞型。GLT-1是一種膠質(zhì)細(xì)胞型谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,提供了超過90%總體Glu的吸收,起著“谷氨酸泵”的作用,防止局部Glu過度積聚引起的興奮性神經(jīng)毒性損害,攝入到膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的Glu在GS的催化作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺(glutamine,Gln),解除Glu的興奮性毒性作用,后者重新回到突觸前神經(jīng)元,在神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化為Glu,參與其再循環(huán)。有研究表明,癲癇患者腦內(nèi)Glu-Gln循環(huán)率明顯降低。TannkaK等發(fā)現(xiàn)GLT-1基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的致命性自發(fā)性癲癇。SaracS等研究也表明,癲癇患者腦內(nèi)GLT-1表達(dá)水平嚴(yán)重不足。GS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Glu代謝的限速酶,使用GS競爭性抑制劑甲硫氨酸砜亞胺能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Glu積聚和谷氨酰胺的減少,引發(fā)興奮性毒性作用,GS表達(dá)增高能增加星形膠質(zhì)細(xì)胞Glu攝取率,有神經(jīng)元保護(hù)作用。GS基因缺陷小鼠也表現(xiàn)出自發(fā)性癇性發(fā)作,癲癇患者海馬區(qū)GS水平明顯降低?！巴‘愔巍笔侵嗅t(yī)辨證論治的特色之一,疾病在某一特定階段的病理本質(zhì),中醫(yī)稱之為證候,對于某一特定疾病證同治同,證異治異。癲癇屬中醫(yī)學(xué)“癇病”范疇,中醫(yī)學(xué)對癇病的認(rèn)識由來已久,朱丹溪在《丹溪心法》中云:“無非痰涎壅塞,迷悶孔竅”,主張“無痰不作癇”,多以定癇丸化裁治療。定癇丸源于《醫(yī)學(xué)心悟》,由天麻、川貝、茯苓、丹參、僵蠶、鉤藤、酸棗仁、郁金、姜半夏、遠(yuǎn)志、膽星、全蝎組成,定癇丸提取液能明顯提高電刺激點(diǎn)燃大鼠后放電閾值,且抗癇作用安全、有效。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·卷二十一·六元正紀(jì)大論篇第七十一》“木發(fā)之郁,太虛?；?云物以擾,大風(fēng)乃至,屋發(fā)折木,木有變。故民病胃脘當(dāng)心而痛,上支兩肋,鬲咽不下通,飲食不下,甚則耳鳴眩轉(zhuǎn),目不識人,善暴僵仆”,受之啟發(fā),名老中醫(yī)陳寶田教授主張“從肝論治”癲癇,并自擬臨床經(jīng)驗方柴胡疏肝湯,治療原發(fā)性癲癇108例,總有效率為85.2%。本課題組前期研究表明,柴胡疏肝湯及定癇丸均能降低PTZ點(diǎn)燃大鼠癇性發(fā)作,降低癲癇大鼠神經(jīng)元興奮性。本研究發(fā)現(xiàn),柴胡疏肝湯及定癇丸均能顯著降低PTZ點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)Glu濃度,推測兩復(fù)方可能通過降低腦內(nèi)Glu的濃度發(fā)揮抗癲癇作用。柴胡疏肝湯及定癇丸均能上調(diào)PTZ點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)GLT-1蛋白的表達(dá)水平及GS的活性,說明兩者可能通過影響Glu的代謝通路,增加Glu的代謝,從而達(dá)到降低癲癇大鼠海馬區(qū)Glu的濃度。但柴胡疏肝湯與定癇丸相比較,柴胡疏