鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠胰島細(xì)胞的損傷機(jī)制

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠胰島細(xì)胞的損傷機(jī)制

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以鏈佐細(xì)菌素（stz）為研究對(duì)象，以1型糖尿病模型大鼠（t1dm）為研究對(duì)象，通過(guò)野外實(shí)驗(yàn)，將具有相同通性的小鼠正常胰島細(xì)胞與模型小鼠脾臟淋巴結(jié)混合，觀察同性同性大鼠正常胰島細(xì)胞的損傷，并探討了stz模型小鼠胰島細(xì)胞的損傷機(jī)制。為深入研究1型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1c型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，7周齡，純度雄性，18株蒼鷺，2g，采集材料1.1.2儀器、試藥和mttSTZ:sigma公司產(chǎn)品;v型膠原酶:北京澤平科技公司;血糖試紙:德國(guó)羅氏公司;尿糖試紙:迪瑞公司;胎牛血清(FCS):Invitrogen公司產(chǎn)品;MTT:sigma公司產(chǎn)品;胰島素試劑盒:美國(guó)佰爾公司。1.1.3血糖儀accu-chckacifACS180型全自動(dòng)免疫分析儀:美國(guó)佰爾公司;血糖儀(ACCU-CHCKActive):德國(guó)羅氏公司;酶標(biāo)儀(InterMedNJ-2100)。1.2方法1.2.1mtt比色法檢測(cè)胰島細(xì)胞受損情況小鼠頸椎脫位處死,無(wú)菌分離胰島細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml,加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔200μl,再分別加10μl不同濃度的STZ-枸櫞酸鹽緩沖液0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml(相當(dāng)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)40mg/Kg)、1.6mg/ml體外混合培養(yǎng)48h,對(duì)照組每孔加入與STZ等量的pH4.00.01M的枸櫞酸緩沖液,設(shè)3復(fù)孔,采用MTT比色法測(cè)OD值來(lái)顯示胰島細(xì)胞受損情況。1.2.2血糖檢測(cè)及模型的制作枸櫞酸鈉緩沖液(0.01mol/l,pH4.0)配制成0.4%STZ溶液,40mg/Kg腹腔注射,每天1次,連續(xù)5天,每周分別測(cè)空腹血糖(末梢全血快速血糖測(cè)定法:剪尾取血,血糖儀檢測(cè))1次,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)1型糖尿病模型形成,以血糖≥11.4mmol/L持續(xù)2周為模型制作成功,低于此值棄去。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),自由飲食、飲水,不限量,喂養(yǎng)4周。1.2.3外觀模型中，大鼠脾淋巴結(jié)對(duì)正常大鼠胰島細(xì)胞的損傷1.2.3.1.模型大鼠和普通大鼠脾臟淋巴結(jié)的制備分別無(wú)菌制備模型鼠與同系正常鼠的脾淋巴細(xì)胞(未純化,含有單核-巨噬細(xì)胞,以下同)的濃度分別為5×106/ml和5×107/ml備用。1.2.3.大鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)將無(wú)菌分離的正常鼠胰島細(xì)胞重懸細(xì)胞濃度為1×106/ml,加入96孔培養(yǎng)板,每孔100μl,每組設(shè)3復(fù)孔。不用STZ致敏。實(shí)驗(yàn)組取上述制備模型鼠脾淋巴細(xì)胞5×106/ml和5×107/ml兩個(gè)濃度的脾淋巴細(xì)胞每孔分別加100μl與正常鼠胰島細(xì)胞混合培養(yǎng)。采用同系正常鼠脾淋巴細(xì)胞5×106/ml和5×107/ml兩個(gè)濃度作為對(duì)照組。置37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。分別于72h、144h、216h,應(yīng)用MTT法檢測(cè)OD值,觀察胰島細(xì)胞受損程度。1.2.3.胰島細(xì)胞培養(yǎng)將0.2mg/mlSTZ10μl與分離的正常鼠1×106個(gè)/ml的胰島細(xì)胞100μl混合培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板24h。然后,再將模型鼠和同系正常鼠的脾淋巴細(xì)胞100μl加入各孔,其余步驟與1.2.3.2相同。1.2.3.胰島細(xì)胞培養(yǎng)將0.2mg/mlSTZ10μl與分離的正常鼠1×106/ml的胰島細(xì)胞100μl混合培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板48h。然后,再將模型鼠和同系正常鼠的脾淋巴細(xì)胞100μl分別加入各孔,其余步驟與1.2.3.2相同。1.2.3.5-胰島素測(cè)試吸出上述各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔中的上清液,采用全自動(dòng)免疫分析儀(化學(xué)發(fā)光原理)檢測(cè)胰島素的分泌量。1.3統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1不同劑量的stz對(duì)外囊細(xì)胞的影響將不同濃度的STZ-枸櫞酸鹽緩沖液和正常Balb/C小鼠的胰島細(xì)胞混合培養(yǎng)48h后,胰島細(xì)胞受損,數(shù)量有不同程度下降,詳見表1。2.2不同大鼠胰島細(xì)胞損傷情況將模型鼠脾淋巴細(xì)胞分別與無(wú)STZ致敏組和STZ致敏組的同系正常鼠胰島細(xì)胞混合培養(yǎng),培養(yǎng)72h、144h、216h胰島細(xì)胞的損傷情況3stz對(duì)胰島細(xì)胞自身免疫損傷的作用國(guó)內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)研究表明T1DM的發(fā)病機(jī)制主要是由于Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答破壞胰島β細(xì)胞,在T1DM后期,逐漸轉(zhuǎn)為Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答,對(duì)Th1細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,使對(duì)胰島細(xì)胞的破壞具有減輕作用。一旦T細(xì)胞凋亡發(fā)生障礙,未被清除而存活下來(lái),在一定條件下就會(huì)發(fā)生自身免疫性疾病。已有研究結(jié)果顯示,以小劑量多次注射STZ的方法建立的1型糖尿病動(dòng)物模型更接近于人類1型糖尿病發(fā)病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了STZ誘導(dǎo)1型糖尿病的發(fā)生機(jī)制。以0.2mg/mlSTZ與正常Balb/C小鼠的胰島細(xì)胞混合培養(yǎng)后,胰島細(xì)胞損傷與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(P>0.05),可用于體外胰島細(xì)胞致敏;以0.4mg/mlSTZ或0.8mg/ml(40mg/Kg)STZ與正常Balb/C小鼠的胰島細(xì)胞混合培養(yǎng)后,胰島細(xì)胞有輕度損傷(P<0.05);以1.6mg/ml(80mg/Kg)STZ與正常Balb/C小鼠的胰島細(xì)胞混合培養(yǎng)后,胰島細(xì)胞損傷非常明顯(P<0.01)。由此推論,大劑量的STZ對(duì)胰島細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒作用;低劑量的STZ對(duì)胰島細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用。這與劉陽(yáng)研究的體內(nèi)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型鼠的STZ劑量基本一致。當(dāng)小劑量使用STZ時(shí),它可以通過(guò)激活免疫學(xué)機(jī)制導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的失代償性病理?yè)p傷;而當(dāng)一次大劑量使用時(shí),則可以通過(guò)DNA烷基化的機(jī)制導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的不可逆的病理?yè)p傷。通過(guò)采用多次腹腔注射STZ的方法,誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型,血糖明顯增高。體外觀察模型鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)同系正常鼠胰島細(xì)胞的損傷作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),在脾淋巴細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml組,無(wú)STZ致敏組、24hSTZ致敏組和48hSTZ致敏組的胰島細(xì)胞損傷及胰島素的分泌量與其各自對(duì)照組比較基本無(wú)明顯變化。而在脾淋巴細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml組中,體外培養(yǎng)72h,無(wú)STZ致敏組和24hSTZ致敏組與其各自對(duì)照組比較胰島細(xì)胞的損傷及胰島素的分泌量具有明顯差異(P<0.05);48hSTZ致敏組與其對(duì)照組比較胰島細(xì)胞的損傷及胰島素的分泌量具有顯著差異(P<0.01)。體外培養(yǎng)144h和216h,無(wú)STZ致敏組、24hSTZ致敏組和48hSTZ致敏組與其各自對(duì)照組比較具有顯著的差異(P<0.01)?？梢?啟動(dòng)胰島細(xì)胞自身免疫性損傷的發(fā)生與同系1型糖尿病模型鼠激活的脾淋巴細(xì)胞數(shù)量及STZ致敏胰島細(xì)胞的次數(shù)和歷時(shí)有關(guān),同時(shí),還與混合培養(yǎng)的天數(shù)密切相關(guān),這與鄒曉蕾等研究的T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移致糖尿病發(fā)生的結(jié)論基本一致。模型鼠脾淋巴細(xì)胞可以損傷未經(jīng)低劑量STZ致敏的同系正常鼠胰島細(xì)胞,證明模型鼠脾淋巴細(xì)胞最終可以誘發(fā)胰島細(xì)胞損傷;模型鼠脾淋巴細(xì)胞可加強(qiáng)損傷低劑量STZ致敏的同系正常鼠胰島細(xì)胞,可以推論細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)只識(shí)別STZ改變的胰島細(xì)胞,并加速其破壞,同時(shí)也說(shuō)明隨著小劑量STZ的累積可以使胰島細(xì)胞的抗原特征改變,使得其成為與胰島細(xì)胞抗原類似的非己抗原而啟動(dòng)了免疫應(yīng)答,對(duì)胰島細(xì)胞發(fā)生交叉性的免疫攻擊,在胰島細(xì)胞對(duì)STZ引發(fā)的自身免疫損傷未及代償時(shí),模型鼠激活的脾淋巴細(xì)胞即引起胰島細(xì)胞的免疫損傷,導(dǎo)致胰島細(xì)胞進(jìn)一步破壞和失去分泌胰島素的功能。證明了小劑量的STZ作為胰島細(xì)胞自身?yè)p害的誘因使自身免疫性T淋巴細(xì)胞逐漸加重胰島細(xì)胞損傷。因此,用小劑量的STZ處理易感動(dòng)物導(dǎo)致胰島細(xì)胞的持續(xù)性破